腸漿膜損傷修復(fù)的第3種巨噬細(xì)胞——GATA6 +腹腔巨噬細(xì)胞

通過(guò)體內(nèi)血液循環(huán)招募骨髓來(lái)源單核細(xì)胞并隨后轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>CS3CR1+巨噬細(xì)胞以響應(yīng)腸道損傷的過(guò)程是依賴于CCR2，Nr4a1和微生物組的。這個(gè)過(guò)程對(duì)于適當(dāng)?shù)慕M織修復(fù)非常重要，然而，GATA6+腹腔巨噬細(xì)胞可能是受損腸道部位可選擇性的，更容易獲得和有功能性的髓細(xì)胞。本文證實(shí)了該猜想，并于2021年12月發(fā)表在《Nature Communications》IF：14919期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、大F4/80^hi巨噬細(xì)胞快速聚集以響應(yīng)無(wú)菌腸道熱損傷

CX3CR1是腸道巨噬細(xì)胞特異性表明標(biāo)志物。利用活體成像和有CX3CR1熒光報(bào)告的小鼠，觀察穩(wěn)態(tài)腸道固有層巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些巨噬細(xì)胞在血管周圍形成一個(gè)指間狀的物理鏈(Fig. 1a)。使用Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+小鼠檢測(cè)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的招募對(duì)無(wú)菌性腸熱損傷的反應(yīng)。熱探針從結(jié)腸漿膜側(cè)創(chuàng)建一個(gè)500μm的局灶性壞死性病變，延伸到固有層。結(jié)果顯示6h內(nèi)CCR2+單核細(xì)胞浸潤(rùn)，而CX3CR1+單核細(xì)胞未浸潤(rùn)。相鄰損傷部位的CX3CR1+巨噬細(xì)胞保持固著，不從原始位置向損傷部位移動(dòng)(Fig. 1b–d)。盡管F4/80抗體具有固著性，但在損傷部位局部應(yīng)用F4/80抗體后，C57BL/6小鼠損傷后2h內(nèi)大F4/80hi巨噬細(xì)胞聚集(Fig. 1e)。這些F4/80hi細(xì)胞的積累在損傷后24h達(dá)到高峰，并持續(xù)至48小時(shí)(Fig. 1e)。為了證實(shí)它們不是來(lái)自單核細(xì)胞，在損傷后6小時(shí)用F4/80抗體對(duì)Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+小鼠進(jìn)行成像。損傷后24 h，CCR2+單核細(xì)胞在損傷部位周圍形成環(huán)狀，并通過(guò)血管積聚，而大F4/80hi細(xì)胞在血管中看不到，其在損傷中心形成大聚集體(Fig. 1f)。重要的是，這些位于腸道損傷部位的大F4/80hi細(xì)胞表達(dá)GATA6，這是一種大腹腔巨噬細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄因子，而不是腸道F4/80+巨噬細(xì)胞(Fig. 1g,h)。

圖1大量F4/80^hi巨噬細(xì)胞快速聚集以響應(yīng)腸道熱損傷

2、腹膜腔來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞聚集至腸道損傷部位不需要CCR2和Nr4a1

Luminex檢測(cè)顯示，損傷后24小時(shí) MCP-1 (CCL2)吸引CCR2+單核細(xì)胞的關(guān)鍵趨化因子，以及中性粒細(xì)胞趨化因子KC在結(jié)腸中高表達(dá)(Fig. 2a)。然而，CCL2和CCL2受體缺失不影響GATA6+巨噬細(xì)胞聚集(Fig. 2b, c)，表明1：CCL2與腹膜巨噬細(xì)胞的聚集無(wú)關(guān)；2：CCR2陽(yáng)性單核細(xì)胞對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞招募并不重要。與野生型小鼠相比，損傷后24和48小時(shí)，Nr4a1-/-小鼠受損腸內(nèi)大F4/80hi細(xì)胞的招募沒(méi)有差異，該鼠損傷部位缺乏Ly6Clo單核細(xì)胞(Fig. 2b, c)。表明大F4/80hi細(xì)胞的聚集不依賴CCR2和Nr4a1。

為了證實(shí)腹膜是大F4/80hiGATA6+巨噬細(xì)胞的來(lái)源，通過(guò)腹腔注射氯磷酸鹽脂質(zhì)體（CLL）敲除掉腹腔巨噬細(xì)胞。腹腔注射CLL不影響腸道內(nèi)CX3CR1+巨噬細(xì)胞分布(Fig. 2d, e)或CCR2+單核細(xì)胞在損傷部分的分布，但是顯著降低了大F4/80hi巨噬細(xì)胞在腸道部分的數(shù)量(Fig. 2f, g)。此外，當(dāng)腹膜注射LysM-eGFP小鼠（腹膜腔中超過(guò)85%的GFP+細(xì)胞為GATA6+巨噬細(xì)胞）的腹膜細(xì)胞至C57BL/6小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在腸道損傷部位積累，但當(dāng)靜脈注射時(shí)GFP+巨噬細(xì)胞則不能進(jìn)入損傷部位(Fig. 2h–j)。而當(dāng)用CLL敲除掉GATA6+巨噬細(xì)胞后再腹膜注射LysM-eGFP小鼠腹膜細(xì)胞時(shí)則不能觀察到細(xì)胞在損傷部位聚集。以上表明是腹膜腔來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞聚集至腸道損傷部位，且該過(guò)程不需要CCR2和Nr4a1。

圖2腹腔巨噬細(xì)胞聚集至腸道損傷部位直接通過(guò)腹腔途徑而不需要CCR2和Nr4a1

3、腹腔巨噬細(xì)胞向腸道損傷部位聚集依賴于ATP和透明質(zhì)酸-CD44的相互作用

ATP是無(wú)菌損傷中一個(gè)重要的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，它召集中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到損傷部位。用apyrase，一種ATPase或ATP受體拮抗劑預(yù)處理可抑制大F4/80hi巨噬細(xì)胞在腸道損傷部位的積聚(Fig. 3a, b)。為了進(jìn)一步探討腹腔巨噬細(xì)胞動(dòng)力學(xué)在腸道損傷中的機(jī)制，阻斷GATA6+腹腔巨噬細(xì)胞上高表達(dá)的白細(xì)胞粘附分子CD44，并對(duì)腸道損傷部位進(jìn)行了成像。Anti-CD44預(yù)處理可防止F4/80hi巨噬細(xì)胞向腸道損傷部位聚集(Fig. 3c, d)。重要的是，免疫熒光染色顯示，CD44的配體透明質(zhì)酸暴露在腸道損傷部位，而不是漿膜表面(Fig. 3e)。用透明質(zhì)酸酶(一種分解透明質(zhì)酸的酶)也能阻止腹腔巨噬細(xì)胞的招募(Fig. 3f)。并且粘膜側(cè)的損傷導(dǎo)致漿膜表面F4/80hi巨噬細(xì)胞的積累，這表明這些積累機(jī)制在嚴(yán)重的粘膜損傷中也有部分作用(Fig. 3g, h)。

圖3腹腔巨噬細(xì)胞向腸道損傷部位的聚集依賴于ATP和透明質(zhì)酸-CD44的相互作用

4、腸道微生物組不是募集GATA6+腹膜巨噬細(xì)胞響應(yīng)腸道損傷的關(guān)鍵

招募CCR2+巨噬細(xì)胞至腸道和轉(zhuǎn)換CX3CR1+單核/巨噬細(xì)胞是依賴于腸道微生物組的無(wú)論是在急性修復(fù)還是穩(wěn)態(tài)翻轉(zhuǎn)中。由于燒傷從漿膜一直延伸到固有層，所以作者預(yù)測(cè)腸道微生物群對(duì)GATA6+腹腔巨噬細(xì)胞的招募至關(guān)重要。從出生前到成年期一直使用廣譜抗生素（Abx）(Fig. 4a)，通過(guò)SYTOX綠色染色檢測(cè)證實(shí)了小鼠腸道菌群數(shù)量的減少(Fig. 4b)。16S測(cè)序也表明了Abx處理小鼠的腸道菌群發(fā)生了顯著改變（Fig. 4c），然而，這些改變對(duì)CD11b^hiF4/80^hiGATA6⁺腹腔巨噬細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有影響，對(duì)腸道損傷部位聚集的大F4/80^hiGATA6⁺巨噬細(xì)胞也沒(méi)有影響(Fig. 4c–f)，表明大腹腔巨噬細(xì)胞募集表型是不依賴于腸道微生物組的。此外，CD44的表達(dá)也沒(méi)有明顯受到腸道菌群巨變的影響(Fig. 4c, d)。

圖4在腸道損傷過(guò)程中腸道微生物組不影響腹腔巨噬細(xì)胞表現(xiàn)和動(dòng)態(tài)

5、腹腔巨噬細(xì)胞促進(jìn)腸道修復(fù)

作者此前研究發(fā)現(xiàn)Ccr2^RFP/RFP小鼠在傷后48h的愈合延遲。熱損傷后24小時(shí)的結(jié)腸延時(shí)成像顯示，大F4/80hi巨噬細(xì)胞已經(jīng)在附近分解SYTOX+壞死細(xì)胞 (Fig. 5a)。接下來(lái)，通過(guò)腹腔注射CLL來(lái)清除腹腔巨噬細(xì)胞后，對(duì)腸道損傷部位SYTOX綠色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行成像。在損傷后48小時(shí)，與PBS -脂質(zhì)體(PBS-L)處理的小鼠相比，CLL處理的小鼠壞死細(xì)胞的清除被延遲 (Fig. 5b, c)。此外，腹腔巨噬細(xì)胞敲除與腸損傷部位血管重建和膠原沉積明顯受損有關(guān)(Fig. 5d–g)。在腹膜macrophage-depleted Ccr2RFP / RFP小鼠中SYTOX-positive細(xì)胞的清除缺乏更加明顯(圖5 b, c)，這表明CCR2+單核細(xì)胞（可變成CX3CR1 +單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）和大GATA6 +腹膜巨噬細(xì)胞都可作用于清除壞死細(xì)胞，也許發(fā)生在小腸的不同層。事實(shí)上，受損結(jié)腸的成像顯示CCR2+單核細(xì)胞主要聚集在固有層，而F4/80hi巨噬細(xì)胞主要聚集在肌層。

圖5腹腔巨噬細(xì)胞促進(jìn)腸道修復(fù)

6、腹腔巨噬細(xì)胞聚集至結(jié)腸以響應(yīng)DSS誘導(dǎo)的腸炎

為了評(píng)估腹膜巨噬細(xì)胞是否可以對(duì)從固有層開(kāi)始并向漿膜發(fā)展的炎癥作出反應(yīng)，小鼠口服含有 4% DSS 的水5天。F4/80抗體局部應(yīng)用于漿膜的LyM- eGFP小鼠結(jié)腸活體顯像顯示LysM+F4/80hi大巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)肌層(Fig. 6a, b)。當(dāng)將來(lái)自LysM-eGFP小鼠的腹膜細(xì)胞腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移到C57BL/6小鼠，一個(gè)類似的積累即腹腔LysM+F4/80hi巨噬細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中積累(Fig. 6c–e)。同樣使用DSS誘導(dǎo)Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+小鼠結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有CCR2+或CX3CR1+信號(hào)與大F4/80hi巨噬細(xì)胞共定位(Fig. 6f)，表明這些是不同的細(xì)胞譜系。這些結(jié)果表明這些大有效性巨噬細(xì)胞來(lái)源于腹腔，而不是脈管系統(tǒng)。關(guān)于這一點(diǎn)，免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎結(jié)腸中透明質(zhì)酸的表達(dá)增加(Fig. 6g, h)。如熱損傷模型所述，Abx治療不影響DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中F4/80hi腹腔巨噬細(xì)胞向結(jié)腸的聚集(Fig. 6i, j)。

圖6在DSS誘導(dǎo)的腸炎中腹腔巨噬細(xì)胞聚集至結(jié)腸

為了進(jìn)一步分析腹腔巨噬細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的作用，通過(guò)腹腔注射CLL敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞然后檢測(cè)并與PBS-L處理的DSS小鼠比較小鼠的體重，疾病活性指數(shù)，結(jié)腸長(zhǎng)度和病理發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)，CLL小鼠的損傷水平和炎癥水平增加，包括更嚴(yán)重的體重丟失和顯著增加的疾病活性指數(shù)(Fig. 7a, b)。此外，CLL處理小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度，這是炎性損傷的標(biāo)志，明顯短于DSS誘導(dǎo)的小鼠但是和PBS處理的沒(méi)有顯著性差異(Fig. 7c)。此外，DSS誘導(dǎo)5天后的結(jié)腸組織切片顯示CLL小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的病理組織損傷，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腸道結(jié)構(gòu)紊亂(Fig. 7d, e)。最后對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎進(jìn)行了腹膜細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估其對(duì)炎癥和癥狀的影響(Fig. 7f)。與PBS處理對(duì)照組相比，腹腔細(xì)胞移植組的疾病活動(dòng)性指數(shù)較低，其他參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig. 7g–k)。

圖7腹腔巨噬細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的腸炎中發(fā)揮了組織修復(fù)功能

總之，在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了第三種有助于組織修復(fù)的巨噬細(xì)胞類型，即GATA6+腹腔巨噬細(xì)胞，它們通過(guò)腹膜途徑在損傷部位迅速積累，以應(yīng)對(duì)漿膜內(nèi)的腸道損傷。alarmin ATP和CD44 -透明質(zhì)酸相互作用是其從腹腔招募到受損腸漿膜的關(guān)鍵，這導(dǎo)致GATA6+腹腔巨噬細(xì)胞組織修復(fù)獨(dú)立于CCR2+單核細(xì)胞來(lái)源的CX3CR1+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（圖8）。令人驚訝的是，當(dāng)DSS結(jié)腸炎引起損傷時(shí)，這些細(xì)胞也可以在腸道中積累，DSS結(jié)腸炎是一種主要開(kāi)始于固有層的損傷。

圖8機(jī)制模式圖：GATA6+腹腔巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)損傷的腸道通過(guò)直接腹膜途徑作用于組織修復(fù)。

參考文獻(xiàn)：

Honda Masaki., Kadohisa Masashi., Yoshii Daiki., Komohara Yoshihiro., Hibi Taizo.(2021). Directly recruited GATA6?+?peritoneal cavity macrophages contribute to the repair of intestinal serosal injury. Nat Commun, 12(1), 7294. doi:10.1038/s41467-021-27614-9