LncRNA NORAD/miR-224-3p/MTDH軸通過(guò)促進(jìn)β-catenin核積累，參與食管鱗狀細(xì)胞癌CDDP耐藥

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是我國(guó)食管癌的主要亞型，占食管癌患者的90%以上。目前，順鉑（cis-diamminedichloro-platinum，CDDP）是治療ESCC的首選藥物。CDDP耐藥是一種惡性的生物學(xué)特性，其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNAs)的異常調(diào)節(jié)是CDDP耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子。然而，本研究探討ESCC中參與CDDP耐藥的LncRNA并闡明其臨床意義和功能機(jī)制。本文于2021.12月發(fā)表于《Molecular Cancer》， IF=15.302。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果

1.在ESCC中，NORAD高表達(dá)與CDDP耐藥相關(guān)

基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，作者首先分析了CDDP敏感和耐藥的食管癌組織中差異表達(dá)的基因，并篩選5個(gè)在CDDP耐藥的組織中差異表達(dá)的LncRNA(Fig. 1a)。這5個(gè)LncRNA在CDDP耐藥的ESCC組織中NORAD表達(dá)量明顯高于CDDP敏感的ESCC組織(Fig. 1b)。 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)NORAD在ESCC組織中的表達(dá)高于正常組織，提示NORAD可能促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生ESCC進(jìn)展(Fig. 1c)。熒光原位雜交顯示在CDDP耐藥的ESCC組織中，NORAD的表達(dá)量明顯高于CDDP敏感的ESCC組織(Fig. 1d)。 臨床分析發(fā)現(xiàn)，NORAD表達(dá)量越高患者預(yù)后越差(Fig. 1e)。ROC曲線顯示NORAD可能是ESCC患者CDDP耐藥的預(yù)測(cè)標(biāo)志物(Fig. 1f)。風(fēng)險(xiǎn)模型顯示發(fā)現(xiàn)NORAD表達(dá)和腫瘤分期都是ESCC患者無(wú)病生存期和總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(Fig. 1g)。

Fig 1 在CDDP耐藥的ESCC組織中，NORAD表達(dá)增加，與患者預(yù)后不良相關(guān)

2.NORAD促進(jìn)體外ESCC CDDP耐藥

為了進(jìn)一步研究CDDP耐藥在ESCC中的作用機(jī)制，作者采用CDDP敏感的親本ESCC細(xì)胞系(KYSE30和TE1)及其等基因耐藥CDDP細(xì)胞 (KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R)用于后續(xù)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R中，NORAD顯著高于相應(yīng)的親本細(xì)胞(Fig. 2a)。通過(guò)熒光原位雜交檢測(cè)到NORAD主要位于ESCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(Fig. 2b)。IC50是指在用藥后存活的細(xì)胞數(shù)量減少一半時(shí)所需的藥物濃度，在KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞系中敲低NORAD，在KYSE30和TE1細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)NORAD，結(jié)果表明，下調(diào)NORAD表達(dá)顯著降低了KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R中的IC50值，表明NORAD降低了耐藥細(xì)胞的敏感性(Fig. 2c)。此外，過(guò)表達(dá)NORAD顯著降低了KYSE30和TE1細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性(Fig. 2d)。此外，NORAD在耐藥細(xì)胞中敲低之后抑制了集群形成能力，表明NORAD基因敲除部分恢復(fù)了這些細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性(Fig. 2e)；與空載體(EV)組相比，用CDDP處理TE1細(xì)胞時(shí)，NORAD過(guò)表達(dá)對(duì)TE1細(xì)胞的增強(qiáng)作用更為顯著(Fig. 2f)。作者接下來(lái)了檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以進(jìn)一步確定NORAD對(duì)ESCC細(xì)胞CDDP耐藥的影響。在CDDP耐藥細(xì)胞中，抑制NORAD顯著增加了CDDP誘導(dǎo)的KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞凋亡(Fig. 2g)；NORAD過(guò)表達(dá)顯著降低了CDDP誘導(dǎo)了KYSE30和TE1細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(Fig. 2h)。 在NORAD敲除的耐藥細(xì)胞中，加劇了KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中CDDP誘導(dǎo)G1期阻滯的情況。當(dāng)在KYSE30和TE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NORAD，CDDP誘導(dǎo)G1期阻滯情況被緩解(Fig. 2i)。γH2AX 是DNA損傷標(biāo)志物，cleaved – caspase-3是凋亡標(biāo)志物。在KYSE30和TE1細(xì)胞中干擾NORAD后，細(xì)胞中γH2AX和cleaved - caspase-3的表達(dá)顯著增加(Fig. 2j)；CDDP誘導(dǎo)的DNA損傷標(biāo)志物γH2AX和凋亡標(biāo)志物cleaved - caspase-3在KYSE30和TE1細(xì)胞中的表達(dá)水平也被NORAD過(guò)表達(dá)降低(Fig. 2k)。

Fig 2 NORAD有助于ESCC的CDDP耐藥性

3. NORAD作為miR - 224 - 3p海綿調(diào)節(jié)ESCC細(xì)胞MTDH的表達(dá)

為找到參與調(diào)控CDDP耐藥的miRNA，作者首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)在CDDP敏感和耐藥的組織中找到3個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(Fig. 3a)。其中miR-224-3p可能與NORAD存在結(jié)合(Fig. 3b)。在KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中，敲除NORAD之后3個(gè)候選差異表達(dá)的miRNAs中只有miR-224-3p的表達(dá)增加(Fig. 3c)。 在5個(gè)片段克隆中敲除NORAD，miR-224-3p在KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中的表達(dá)增加均顯著上調(diào)(Fig. 3d)。表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)在ESCC組織中，只有miR-224-3p與NORAD呈負(fù)相關(guān)(Fig. 3e)。此外，KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中的miR-224-3p表達(dá)低于相應(yīng)的親本細(xì)胞(Fig. 3f)。在藥物敏感細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NORAD，miR-224-3p表達(dá)量降低(Fig. 3f)。亞細(xì)胞定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NORAD和miR-224-3p都是定位于ESCC細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中(Fig. 3h，i)。將攜帶NORAD-WT或NORAD突變型的熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染到，KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中，再轉(zhuǎn)染miR-224-3P模擬物。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染NORAD-WT和第二個(gè)NORAD突變型中，miR-224-3p模擬物能降低，KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中NORAD的熒光素酶活性。相比之下，轉(zhuǎn)染NORAD- mut #1的KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中，NORAD的熒光素酶活性沒(méi)有被miR-224-3p模擬物降低(Fig. 3j)。此外，RIP-PCR結(jié)果顯示NORAD和miR-224-3p在ESCC細(xì)胞中形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC）(Fig. 3j)

Fig 3 NORAD充當(dāng)海綿吸附ESCC中的miR-224-3p

4. MTDH是miR-224-3p的直接靶點(diǎn)

生信工具預(yù)測(cè)了miR-224-3p潛在調(diào)控的405靶點(diǎn)，通再過(guò)生信靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和耐藥和敏感的ESCC組織之間的差異mRNA的分析，找到1個(gè)重疊區(qū)，也就是MTDH(Fig.4ab)。免疫組化檢測(cè)到MTDH主要位于ESCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(Fig.4c)。接下來(lái)檢測(cè)了CDDP耐藥和敏感食管癌細(xì)胞中MTDH的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)，KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中MTDH表達(dá)明顯高于相應(yīng)的親本細(xì)胞(Fig.4 d)，生信預(yù)測(cè)到MTDH的3’-UTR區(qū)中有4個(gè)位點(diǎn)有可能與miR-224-3p結(jié)合，接下來(lái)作者構(gòu)建了MTDH-3′-UTR的4個(gè)不同的突變序列(e.g. MTDH-3′-UTR-Mut#1， MTDH-3′-UTR-Mut#2，MTDH-3′-UTR-Mut#3 and MTDH-3′-UTR-Mut#4) (Fig.4 e)。然后將攜帶MTDH-3-UTR-WT或MTDH-3-UTR Mut的報(bào)告基因?qū)肽退幖?xì)胞，再共轉(zhuǎn)染miR-224-3p模擬物(Fig.4 f)。轉(zhuǎn)染miR-224-3模擬物后顯著降低了MTDH-3-UTR-WT，以及其中3個(gè)MTDH-3’--UTR-mut的耐藥細(xì)胞中的MTDH的熒光素酶活性。說(shuō)明miR-224-3p與MTDH-3′-UTR-Mut#1結(jié)合。WB得到相同的結(jié)果(Fig.4 g)。接下來(lái)為了研究NORAD是否通過(guò)吸附miR-224-3p上調(diào)MTDH的表達(dá)，作者在KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中用shRNA敲除NORAD，并轉(zhuǎn)染miR-224-3p抑制劑。結(jié)果顯示， NORAD基因敲除后MTDH的表達(dá)明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-224-3p抑制劑后抑制了這種效果(Fig.4 h)。接下來(lái)，在KYSE30和TE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NORAD顯著增加了MTDH的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-224-3p模擬物部分挽救了這種上調(diào)(Fig.4 i)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-224-3p與NORAD和MTDH呈負(fù)相關(guān)， NORAD與MTDH呈正相關(guān)(Fig.4i)。

Fig4 MTDH是miR-224-3p的直接靶點(diǎn)

5. NORAD/miR?224?3p/MTDH軸通過(guò)調(diào)節(jié)B-活性進(jìn)而促進(jìn)耐藥以及ESCC進(jìn)展

接下來(lái)，作者用CDDP處理KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞，以確定NORAD/ miR-224-3p/MTDH軸在ESCC細(xì)胞中的作用。敲低NORAD可部分消除KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中的CDDP耐藥性，而miR-224-3p抑制劑則增強(qiáng)了耐藥性。隨著NORAD過(guò)表達(dá)，KYSE30和TE1細(xì)胞中的敏感性下降，而miR-224-3p模擬物中和了這一現(xiàn)象（Fig 5a）。 此外，隨著敲除NORAD，CDDP誘導(dǎo)的KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞中的凋亡率增加，這種效果通過(guò)共轉(zhuǎn)染miR-224-3p抑制劑來(lái)拯救；同時(shí)，過(guò)表達(dá)NORAD，CDDP誘導(dǎo)的TE1和KYSE30細(xì)胞凋亡率降低，這種效果能隨著轉(zhuǎn)染miR-224-3p模擬物拯救（Fig 5b）。此外，敲低NORAD促進(jìn)了CDDP誘導(dǎo)的誘導(dǎo)G1期阻滯，而miR-224-3p抑制劑挽救了這種增長(zhǎng)；同樣，miR-224-3p模擬物部分中和了在KYSE30和TE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CDDP誘導(dǎo)的G1期阻滯（Fig 5c-d）。為確定NORAD/ miR-224-3p/MTDH軸可能的下游信號(hào)通路。于是通過(guò)WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染NORAD和miR-224-3p模擬物細(xì)胞中不同通路的相關(guān)蛋白表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)敲除NORAD下調(diào)了磷酸化-β連環(huán)蛋白的表達(dá)，而且這種下調(diào)趨勢(shì)能被miR-224-3p抑制劑中和（Fig 5e）。接下來(lái)分析了NORAD對(duì)β連環(huán)蛋白在ESCC細(xì)胞中的定位情況。WB結(jié)果顯示敲低NORAD基因后，ESCC細(xì)胞的細(xì)胞核中β連環(huán)蛋白降低，細(xì)胞質(zhì)中β連環(huán)蛋白升高（Fig 5f）。此外，作者通過(guò)免疫熒光染色觀察NORAD/miR-224-3p/MTDH軸對(duì)ESCC細(xì)胞中β-catenin亞細(xì)胞位置的影響。與WB結(jié)果一致（Fig 5G）。敲除NORAD或MTDH再共轉(zhuǎn)染miR-224-3p模擬物可減少耐藥細(xì)胞中β連環(huán)蛋白的核積累（Fig 5G）。

Fig 5 NORAD/miR-224-3p/MTDH軸通過(guò)促進(jìn)β-catenin的核積累來(lái)促進(jìn)ESCC細(xì)胞對(duì)CDDP的耐藥性

6.  NORAD/miR-224-3p/MTDH軸促進(jìn)ESCC細(xì)胞的進(jìn)展

通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低NORAD抑制了KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R細(xì)胞的遷移和侵襲，而miR-224-3p抑制劑減弱了這種抑制（Fig 6A，B）。 敲低NORAD后，檢測(cè)遷移和入侵相關(guān)因子的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)量增高，N-cadherin和MMP9表達(dá)量降低，而miR-224-3p抑制劑則中和了這些改變，在KYSE30和TE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NORAD則效果相反（Fig 6C）。綜上所述， NORAD/miR-224-3p/MTDH軸促進(jìn)β-catenin的核積累，激活該蛋白，從而促進(jìn)了ESCC細(xì)胞對(duì)CDDP的耐藥和進(jìn)展。

Fig 6 NORAD/miR-224-3p/MTDH軸促進(jìn)ESCC細(xì)胞的進(jìn)展 

7.  NORAD在體內(nèi)促進(jìn)CDDP的耐藥和ESCC的生長(zhǎng)

將8只雌性ESCC小鼠隨機(jī)分成2組注射對(duì)CDDP耐藥和敏感細(xì)胞（用于注射的CDDP耐藥食管癌細(xì)胞之前sh-NORAD或sh-NC處理，CDDP敏感的細(xì)胞過(guò)表達(dá)NORAD），一周后，給小鼠腹腔注射指定濃度的CDDP或PBS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞來(lái)源的異種移植瘤，經(jīng)CDDP處理后腫瘤體積明顯小于對(duì)照組， MTDH表達(dá)降低，但腫瘤依然持續(xù)生長(zhǎng)。第4周開(kāi)始，轉(zhuǎn)染NORAD敲低處理細(xì)胞的小鼠中注射CDDP的腫瘤顯著消退，說(shuō)明NORAD發(fā)揮了抑制作用（Fig 7a）。經(jīng)NORAD過(guò)表達(dá)載體預(yù)處理的KYSE30細(xì)胞轉(zhuǎn)染到小鼠中即使在CDDP處理下也能形成持續(xù)生長(zhǎng)的腫瘤（Fig 7b）。接下來(lái)，作者通過(guò)免疫組化法檢測(cè)sh-NORAD的KYSE30/CDDP-R細(xì)胞中的MTDH的表達(dá)量，MTDH的表達(dá)明顯低于未處理的KYSE30/CDDP-R細(xì)胞。同樣，在過(guò)表達(dá)NORAD 的KYSE30細(xì)胞的異種移植瘤中，MTDH的表達(dá)量高于EV細(xì)胞（Fig 7c）。在ESCC細(xì)胞中β-catenin的核表達(dá)與MTDH呈正相關(guān)（Fig 7d）。此外，CDDP誘導(dǎo)與γH2AX和cleaved caspase-3表達(dá)正相關(guān)，與異種移植腫瘤中MTDH呈負(fù)相關(guān)（Fig 7e-f）。 綜上所述，這些結(jié)果表明，NORAD通過(guò)促進(jìn)β-catenin的核積累，促進(jìn)了ESCC細(xì)胞CDDP耐藥性的進(jìn)展和發(fā)展（Fig 7G）。

Fig 7 NORAD/miR-224-3p/MTDH軸有助于ESCC體內(nèi)CDDP耐藥

本研究中，作者發(fā)現(xiàn)NORAD是參與體外和體內(nèi)ESCC CDDP耐藥的關(guān)鍵lncRNA NORAD作為miR-224-3p海綿吸附miR-224-3p，降低miR-224-3p的表達(dá)水平，提高MTDH的表達(dá)量，促進(jìn)β-catenin磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的核積累，提高 ESCC細(xì)胞CDDP耐藥性。

參考文獻(xiàn)：

Jia Y.，et al.，Long non-coding RNA NORAD/miR-224-3p/MTDH axis contributes to CDDP resistance of esophageal squamous cell carcinoma by promoting nuclear accumulation of beta-catenin. Mol Cancer，2021. 20(1): p.162.