褪黑素和維替泊芬通過調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)協(xié)同抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生長和干細(xì)胞特性

 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）是一種發(fā)生于口腔、咽和喉部的惡性腫瘤，其5年生存率大約只有50%，研究與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在機(jī)制是發(fā)展HNSCC治療的關(guān)鍵。腫瘤干細(xì)胞（CSCs）具有無限的自我更新能力和腫瘤啟動(dòng)能力，參與了HNSCC的腫瘤進(jìn)展、治療耐藥性和復(fù)發(fā)，而靶向CSC相關(guān)通路的藥物是癌癥治療的顯著療法。目前，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素（Mel）和維替泊芬（VP）具有抗腫瘤作用，可調(diào)節(jié)線粒體自噬，減弱EMT和相關(guān)干細(xì)胞特性。該研究發(fā)表在《JOURNAL OF PINEAL RESEARCH》，IF:13.007。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.   HNSCC CSCs在低ROS水平和腫瘤球體形成能力的細(xì)胞培養(yǎng)中富集

在許多類型的癌細(xì)胞中，ROS水平可用于豐富CSC群體，因?yàn)?/span>CSC居住在相對(duì)較低的ROS條件下，以維持靜止和自我更新。此外，在3D培養(yǎng)中生長的癌細(xì)胞由于不均勻地暴露于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，可表現(xiàn)出增加的致瘤表型。因此，采用低生理活性氧水平和球體形成特性的細(xì)胞培養(yǎng)來研究HNSCC中的CSC亞群（圖1）。在正常細(xì)胞中，CD44+CD24-和CD133+細(xì)胞亞群分別為10.1%和1.14%（圖1A）。用CellROX對(duì)低活性氧和高活性氧種群分類，細(xì)胞內(nèi)ROS水平被廣泛地用于豐富CSC（圖1B）。細(xì)胞分選后， CD44+CD24和CD133+細(xì)胞（ROS-low細(xì)胞）明顯高于CD44+CD24和CD133+細(xì)胞（ROS-high細(xì)胞）和正常細(xì)胞（圖1C-E）。ROS-low細(xì)胞表現(xiàn)出由CPDL和順鉑耐藥性（cisplatin）決定的CSC特性（圖1F，G）。同樣， CD44+CD24細(xì)胞和CD133+細(xì)胞數(shù)量分別增加了42.9%和3.41%（圖1H-J）。3D培養(yǎng)的SCC-25細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)（圖1K）。這些結(jié)果表明，在3D培養(yǎng)以及低水平ROS的條件下，HNSCC培養(yǎng)物含有豐富的干細(xì)胞群，并表現(xiàn)出CSC樣特性。

圖1 在ROS-low和球形細(xì)胞培養(yǎng)中CSCs的特性

2.  Mel和VP聯(lián)合處理可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低HNSCC細(xì)胞的CSC樣特性

為了證明Mel和VP對(duì)HNSCC生長的影響，分析了Mel或VP處理后SCC-25細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖2A）。單用Mel或VP以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞活力（圖2A）。無論細(xì)胞ROS水平如何，Mel （1 mM）和VP （2.5 μm）聯(lián)合處理對(duì)HNSCC細(xì)胞活性有協(xié)同作用（圖2B）。盡管聯(lián)合治療組中觀察到pAkt/Akt的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但治療并未改變pAkt/Akt的表達(dá)。在聯(lián)合治療組中，Cleaved Cas-3/Cas-3表達(dá)上調(diào)，表明Mel和VP促進(jìn)HNSCC細(xì)胞凋亡（圖2C，D）。治療后進(jìn)一步觀察SCC-25細(xì)胞的CSCs特征。Mel和VP單獨(dú)處理降低了細(xì)胞的成球能力，增加了細(xì)胞的線粒體ROS水平（圖2E-J）。此外，聯(lián)合處理大大降低了細(xì)胞的成球能力和CSC數(shù)量，而增加線粒體ROS的產(chǎn)生（圖2E-J）。這些結(jié)果表明，Mel和VP抑制了HNSCC細(xì)胞的活力，并降低了HNSCC的特性和種群數(shù)量。

圖2 Mel和VP對(duì)CSC性能的影響

3.  Mel和VP抑制與線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)

由于線粒體自噬與癌細(xì)胞的增殖和死亡有關(guān)，進(jìn)一步研究了Mel和VP對(duì)SCC-25細(xì)胞中參與線粒體自噬的基因表達(dá)的影響（圖3）。VP單獨(dú)降低了PINK1的表達(dá)，與Mel聯(lián)合顯著降低了PINK1和parkin的表達(dá)（圖3A,B）。用Mel和VP處理ROS低和ROS高的SCC-25細(xì)胞，研究其對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。兩種ROS分類的細(xì)胞與正常的SCC-25細(xì)胞表現(xiàn)出相似的模式（圖3C-F）。聯(lián)合治療降低了PINK1和parkin的表達(dá)，而與細(xì)胞內(nèi)ROS水平無關(guān)。然而，線粒體網(wǎng)絡(luò)相關(guān)蛋白FIS1（線粒體分裂）的片段化并未因治療而改變（圖3A-F）。綜上所述，這些結(jié)果表明Mel和VP通過線粒體自噬而不改變線粒體分裂來抑制HNSCC的生存能力。

圖3 Mel和VP治療后對(duì)線粒體自噬的調(diào)節(jié)

4.   Mel和VP可誘導(dǎo)線粒體功能障礙，減少線粒體自噬

使用TMRE（線粒體膜電位）染色標(biāo)記活性線粒體，以顯示Mel和VP在線粒體損傷中的作用。Mel或VP單獨(dú)降低線粒體膜電位，它們的結(jié)合協(xié)同使線粒體失活（圖4A,B）。此外，用parkin和TOM20對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察ROS-low和ROS-high細(xì)胞的線粒體形態(tài)和線粒體自噬的表達(dá)（圖4C,D）。聯(lián)合治療降低了ROS-low和ROS-high細(xì)胞中parkin和TOM20的表達(dá)。染色結(jié)果顯示，對(duì)照組的parkin/TOM20表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中。該治療改變了相互連接的線粒體網(wǎng)絡(luò)，并將parkin/TOM20移至靠近細(xì)胞核的位置（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，Mel和VP觸發(fā)線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體自噬減少。

圖4 Mel和VP治療后線粒體功能和線粒體自噬的研究

5.  Mel和VP對(duì)HNSCC的抑制作用是通過調(diào)節(jié)YAP信號(hào)和PINK1依賴的線粒體動(dòng)力學(xué)介導(dǎo)的

為了研究Mel和VP與YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)性，分析了Mel和VP處理后SCC-25細(xì)胞中YAP靶基因CCN1的表達(dá)（圖5A-C）。Mel和VP單獨(dú)降低了CCN1的RNA表達(dá)（圖5A）。Mel和VP共同作用后，CCN1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低（圖5A-C），說明Mel和VP可能直接下調(diào)YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致YAP靶基因CCN1的表達(dá)下降。MPP+ iodide（碘化物）進(jìn)一步證實(shí)了線粒體功能障礙對(duì)HNSCC的影響。MPP+ iodide抑制線粒體復(fù)合物I，并消耗內(nèi)源性PINK1，導(dǎo)致線粒體損傷。MPP+ iodide以劑量依賴性的方式顯著降低細(xì)胞活力（圖5D）。進(jìn)一步評(píng)估MPP+ iodide處理的SCC-25細(xì)胞中CD44+CD24細(xì)胞的百分比（圖5E,F）。MPP+ iodide未改變CD44+CD24細(xì)胞群。這些結(jié)果表明，抑制PINK1可導(dǎo)致HNSCC細(xì)胞死亡，而不影響干細(xì)胞數(shù)量。

圖5 Mel和VP對(duì)YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控及PINK1依賴線粒體動(dòng)力學(xué)的抑制作用

6. Mel和VP抑制HNSCC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移

EMT在促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Mel和VP對(duì)EMT介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展的影響，分析了SCC-25細(xì)胞中上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)（圖6A,B）。TGF-β1誘導(dǎo)SCC-25細(xì)胞發(fā)生EMT：包括Vim和N-cad在內(nèi)的間質(zhì)標(biāo)志物在TGF-β1作用下表達(dá)升高，而E-cad在TGF-β1作用下表達(dá)略有降低（圖6A,B）。聯(lián)合治療組間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)顯著降低，而上皮標(biāo)志物的表達(dá)在各治療組中略有恢復(fù)（圖6A,B）。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mel或VP均顯著減少了傷口愈合面積。此外，聯(lián)合治療后細(xì)胞很少增殖并遷移到劃傷區(qū)域（約4%）（圖6C,D）。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，Mel和VP減少了向上腔室下表面遷移的細(xì)胞數(shù)量（圖6E,F）。此外，與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2和MMP-9在Mel和VP處理的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)（圖6G,H）。這些發(fā)現(xiàn)提示Mel和VP可能是HNSCC中EMT、遷移和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子。

圖6 Mel和VP治療后EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用

主要研究結(jié)論：

綜上所述，研究結(jié)果表明ROS-low HNSCC細(xì)胞和HNSCC的3D球形培養(yǎng)物表現(xiàn)出增強(qiáng)的CSC特性。此外，Mel和VP通過調(diào)節(jié)HNSCC中的PINK1/parkin/TOM20軸，導(dǎo)致線粒體損傷和線粒體吞噬功能降低。Mel和VP聯(lián)合治療通過調(diào)節(jié)EMT減少癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，Mel和VP聯(lián)合治療可能是HNSCC患者的潛在治療策略。