M2巨噬細(xì)胞外泌體裝載小檗堿治療脊髓損傷
脊髓損傷（SCI）導(dǎo)致巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫激活。激活的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞具有兩種表型：M1促炎經(jīng)典活化表型和M2抗炎選擇性活化表型。SCI的治療由于缺乏能穿越血腦屏障（BBB）且具有靶向性和有效抗炎藥物，因而面臨巨大挑戰(zhàn)。本文發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞來源的外泌體裝載小檗堿可用于治療SCI通過抑制M1炎癥激活和抗凋亡。本文于2021年5月發(fā)表在《Acta Biomaterialia》IF：8.947期刊上。
技術(shù)路線：
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、外泌體鑒定
Exos和Exos-Ber使用低溫超速離心法收集，電鏡下觀察到的形態(tài)如圖1A所示，Exos具有一個(gè)完全薄膜結(jié)構(gòu)，大約125nm大小。裝載Ber后結(jié)構(gòu)無明顯變化。Exos和Exos-Ber顆粒大小的分布都在125±12nm。Exos-Ber熒光共定位顯示DiD標(biāo)記的外泌體膜具有紅色熒光和Ber綠色熒光，合并圖像表明Ber已經(jīng)裝載至外泌體中，因?yàn)榫G色熒光在紅色熒光里面（圖1C）。WB在Exos和Exos-Ber中都檢測到了典型的外泌體標(biāo)志物的表達(dá)。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明在7天內(nèi)Exos和Exos-Ber都無明顯改變，說明藥物裝載系統(tǒng)穩(wěn)定（圖1E）。此外，凍干前后Exos-Ber的大小和zeta電位無明顯變化（圖1F）。
2、藥物裝載，釋放，和Exo-Ber的攝取
用超聲波將Ber裝入Exos中。圖2A中，Exo-Ber中Ber含量超聲波法(17.13±1.64%)高于孵育法(5.00±0.70%)。隨后進(jìn)行體外釋藥試驗(yàn)，結(jié)果如圖2B所示。Exo-Ber在體外表現(xiàn)出緩慢的釋放行為。48 h累積釋放量為71.44±2.86%。在體外細(xì)胞攝取試驗(yàn)中，清楚地觀察到，隨著時(shí)間的推移，Exos被BV2細(xì)胞的攝取增加(圖2C-2D)。此外，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證明了Exos的攝取，并顯示出時(shí)間依賴性(圖2E)。
3、Exo靶向評估
為了驗(yàn)證Exo穿透BBB的能力，作者構(gòu)建了一個(gè)體內(nèi)SCI模型小鼠，在尾靜脈注射Exo-Ber后的1，3，6，12和24h進(jìn)行體內(nèi)成像，如圖3A所示，對照ReVs顯示出自然被動定位，在注射12小時(shí)后只有少量聚集在損傷部位，而與此相反，Exos表現(xiàn)出積極的靶向效應(yīng)，受損部位的熒光強(qiáng)度在在注射3h后顯著增加并隨著時(shí)間逐漸增長。在12h，增長趨勢下降，熒光強(qiáng)度在24h到達(dá)峰值（圖3B）。大腦和脊髓的組織成像進(jìn)一步證明了Exos的靶向性（圖3C）。
圖3 體內(nèi)靶向Exo-Ber
4、體外抗炎效果
巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞體外LPS處理后極化為M1型促炎細(xì)胞(表達(dá)iNOS)。如圖4A所示，LPS組表達(dá)強(qiáng)烈iNOS綠色熒光，意味著M1極化，Ber組和Exo組具有相對較弱的綠色熒光，表明它們都可以抑制M1極化。Exo-Ber表現(xiàn)出最弱的綠色熒光，說明具有最好的M1極化抑制效果。M2巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞是抗炎細(xì)胞（表達(dá)CD206），Exos-Ber誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化（圖4B）。流式得出和免疫熒光一樣的結(jié)果（圖4C-4D）。促炎因子（TNFα, IL-1β and IL-6）的水平在LPS組最高，相比之下，Ber組和Exo組的水平顯著降低，而Exos-Ber組的促炎因子水平最低表明具有最好的抗炎效果（圖4E）。
圖4表征Exos-Ber在體外抑制M1 BV2細(xì)胞激活和促進(jìn)M2 BV2細(xì)胞極化特性
5、Exos-Ber保護(hù)神經(jīng)元并促進(jìn)SCI后的運(yùn)動功能恢復(fù)
圖5A展示了構(gòu)建模型過程中的SCI小鼠的傷口表面圖像。為了評估Exos-Ber治療效果，使用了BMS得分評估SCI小鼠的運(yùn)動恢復(fù)，如圖5B，在第3天和第7日安，只有Exos-Ber組小鼠得分顯著升高，并隨著時(shí)間發(fā)展得分越來越高，而其余組則沒有顯著升高，表面Exos-Ber組具有最好的恢復(fù)效果，其小鼠足底頻繁且持續(xù)站立，但仍不穩(wěn)定（圖5C）。此外，各組小鼠的體重?zé)o顯著差異，PBS組小鼠體重在傷后一周逐漸恢復(fù)，Exos-Ber組傷后1周體重略有下降，后逐漸好轉(zhuǎn)，28 d時(shí)體重略有增加。為探討Exos-Ber對脊髓損傷后運(yùn)動神經(jīng)元存活的影響，采用尼氏染色法觀察脊髓損傷后運(yùn)動神經(jīng)元存活情況。與PBS組相比，Ber組和Exos組的神經(jīng)元數(shù)量增，Exos-Ber組神經(jīng)元更多，證實(shí)了Exos-Ber恢復(fù)效果良好（圖5E）。為了評估Exos-Ber的安全性，對各種器官和組織(心、肝、脾、肺和腎)進(jìn)行了HE染色。結(jié)果如圖5F所示，未發(fā)現(xiàn)明顯變化，說明Exos-Ber具有生物安全性。
圖5 Exos-Ber可以更好的促進(jìn)SCI后神經(jīng)元存活和功能恢復(fù)和準(zhǔn)備工作的安全性評價(jià)
6、體內(nèi)抗炎效果
為探討Exos-Ber對脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的抑制程度，采用Elisa和western blotting檢測脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平，評價(jià)損傷部位的炎癥反應(yīng)水平。如圖6A和6B所示，與sham組相比，PBS組炎癥因子水平顯著升高，與PBS組相比，Ber組和Exo組其水平都顯著下降，但是和Exo組比較，Exo-Ber組的水平再次下降，表明Exo-Ber抗炎效果最好。隨后用免疫熒光檢測了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)Exo-Ber抑制M1標(biāo)記物表達(dá)的效果最顯著，促進(jìn)M2標(biāo)記物的能力也最顯著，表明Exo-Ber可以抑制巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞極化。
圖6 Exo-Ber可以減輕受損部位炎癥反應(yīng)通過抑制M1巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞激活
隨后作者還檢測了抗凋亡蛋白（(caspase-9, caspase-8, Bcl-2, BAX, BAX/Bcl-2）以評估Exo-Ber的抗凋亡作用。如圖7A所示，與PBS組相比，Exo組，Ber組和Exo-Ber組的這些蛋白表達(dá)水平顯著下降，表明它們具有抗凋亡作用，而Exo-Ber具有最佳效果。圖7Bcleavedcaspase 3/Neun免疫熒光結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。
圖7 Exos-Ber抑制SCI小鼠的神經(jīng)元凋亡
總之，在本研究中，作者成功制備了粒徑約125 nm的Exos-Ber，封裝效率約為17.13%。Exos的自然靶向能力可以實(shí)現(xiàn)Ber在損傷部位的高濃度積累。藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，與Ber溶液相比，Exos-Ber的生物利用度提高了3.2倍。Exos-Ber誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，由促炎M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎M2型小膠質(zhì)細(xì)胞過渡，抑制促炎因子的表達(dá)，它還能減少脊髓損傷后的神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)。綜上所述，Exos-Ber是治療脊髓損傷較好的抗炎藥物。
參考文獻(xiàn)：
Gao Zhan-Shan., Zhang Chuan-Jie., Xia Nan., Tian He., Li Dao-Yong., Lin Jia-Quan., Mei Xi-Fan., Wu Chao.(2021). Berberine-loaded M2 macrophage-derived exosomes for spinal cord injury therapy. Acta Biomater, 126(undefined), 211-223. doi:10.1016/j.actbio.2021.03.018