FLT4/VEGFR3激活A(yù)MPK，以協(xié)調(diào)糖代謝重編程與自噬和炎癥小體激活

巨噬細(xì)胞快速進(jìn)行糖酵解重編程響應(yīng)巨噬/自噬，炎癥小體激活和清除細(xì)菌。識(shí)別參與其中的關(guān)鍵分子將提供關(guān)鍵的潛在治療應(yīng)用。作者在本研究中闡明了LT4-AMPK模塊協(xié)調(diào)糖酵解重編程、自噬、炎癥小體激活和焦死來(lái)消滅入侵細(xì)菌的分子機(jī)制。本研究2021年10月發(fā)表在《AUTOPHAGY》，IF=9.77。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1.     FLT4/VEGFR3激活AMPK，以協(xié)調(diào)糖代謝重編程與自噬和炎癥小體激活，以消除細(xì)菌

為了了解糖酵解重編程的改變是如何與細(xì)菌清除聯(lián)系在一起的，作者在flt4^WT/WT(野生型)小鼠細(xì)胞內(nèi)感染來(lái)源于鼠傷寒菌株SL1344菌株后，檢測(cè)了靶器官肝臟中的糖代謝譜和傷寒鏈球菌的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有直接抗菌活性的檸檬酸和NAD (P) H在肝臟感染后大量增加。相比之下，與PBS處理的flt4^WT/WT小鼠相比，SL1344感染的flt4^WT/WT小鼠肝臟中琥珀酸鹽和乳酸鹽的濃度降低，可促進(jìn)促炎巨噬細(xì)胞功能(Figure 1A)。因?yàn)橹白C明了flt4突變小鼠缺乏細(xì)胞外配體結(jié)合域(LBD:缺乏免疫球蛋白樣域2和3，命名為flt4^ΔLBD/ΔLBD)更容易感染。因此，作者比較了Flt4^WT/WT小鼠和flt4^ΔLBD/ΔLBD小鼠的糖酵解重編程變化。與Flt4^WT/WT小鼠不同， flt4^ΔLBD/ΔLBD小鼠檸檬酸和NAD(P)H未能增加。此外，Flt4^WT/WT小鼠琥珀酸和乳酸的產(chǎn)量減少，而突變小鼠顯示出這些代謝物的產(chǎn)量增加(Figure 1B-F)。此外，flt4^ΔLBD/ΔLBD小鼠肝臟和脾臟中鼠鼠傷寒桿菌數(shù)量顯著增加(Figure 1G)。

作者通過(guò)評(píng)估巨噬細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒鏈球菌的菌落形成單位(cfu)來(lái)研究FLT4如何影響細(xì)菌清除。與體內(nèi)抗細(xì)菌反應(yīng)缺陷相似，flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細(xì)胞與Flt4WT/WT巨噬細(xì)胞相比，攜帶的鼠傷寒桿菌數(shù)量要多得多。 由于包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的吞噬細(xì)胞可以吞噬固體顆粒，這是殺死細(xì)菌的關(guān)鍵過(guò)程，作者首先檢測(cè)了FLT4信號(hào)通路是否影響吞噬能力。將GFP(綠色熒光蛋白)-大腸桿菌(e.c oli-GFP)與flt4ΔLBD/ΔLBD小鼠或與flt4WT/WT同窩的小鼠的腹腔滲出物巨噬細(xì)胞PEM(腹腔滲出物巨噬細(xì)胞)共孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示flt4ΔLBD/ΔLBD PEMs對(duì)大腸桿菌GFP的吞噬量低于Flt4WT/WT PEMs (Figure 1I)。溶酶體的酶可以幫助巨噬細(xì)胞消滅細(xì)菌。接下來(lái)，作者評(píng)估了吞噬酶體的成熟是否受到flt4的調(diào)控。聚焦顯微鏡成像顯示內(nèi)化的鼠傷寒桿菌GFP與裝載LysoTracker Red的野生型BMDMs共定位(Figure 1J)。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明，flt4可以通過(guò)增加吞噬、ROS的產(chǎn)生和自噬小體的成熟來(lái)促進(jìn)細(xì)菌的清除，并伴隨著糖代謝的改變。

Fig 1 巨噬細(xì)胞表面受體flt 4控制糖酵解重編程和細(xì)菌清除

2.     FLT4在清除鼠傷寒桿菌過(guò)程中保護(hù)巨噬細(xì)胞免遭細(xì)胞凋亡

鼠傷寒鏈球菌感染可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡，其特征是細(xì)胞腫脹，膜囊迅速擴(kuò)張、破裂和核凝結(jié)。在圖2A中，在傷寒沙門氏菌感染期間，flt 4ΔLBD/ΔLBDPEMs細(xì)胞死亡數(shù)量增加，呈腫脹形狀(Figure 2B)，在FLT4WT/WT巨噬細(xì)胞中，存在大量含有細(xì)菌殘?bào)w的吞噬-溶酶體空泡。感染的flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細(xì)胞的細(xì)胞死亡率高于Flt4WT/WT細(xì)胞(Figure 2C, D)。由于甘氨酸處理可降低胞質(zhì)釋放水平乳酸脫氫酶(LDH)和保護(hù)細(xì)胞免于焦亡，作者用這個(gè)方法來(lái)鑒定焦亡。作者發(fā)現(xiàn)甘氨酸治療可以保護(hù)flt4ΔLBD/ΔLBD或Flt4WT/TKmut的巨噬細(xì)胞，其保護(hù)水平與WT細(xì)胞在傷寒沙門氏菌感染后的保護(hù)水平相當(dāng)(Figure 2E）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，flt4保護(hù)巨噬細(xì)胞免受SL-1344感染引起的細(xì)胞凋亡。

炎癥小體的激活和隨后的焦亡是抵抗細(xì)菌感染的關(guān)鍵防御。因此，作者通過(guò)ELISA分析細(xì)胞上清液中成熟IL1B濃度來(lái)研究炎癥小體的活化。事實(shí)上，F(xiàn)LT4ΔLBD/ΔLBD PEMs或BMDMs分泌的IL1B水平遠(yuǎn)高于對(duì)照細(xì)胞(Figure 2F, G)。此外，flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細(xì)胞中IL1B的增加與感染FLT4ΔLBD/ΔLBD小鼠的葡萄糖代謝產(chǎn)物包括琥珀酸和乳酸鹽的增加是一致的(Figure 1A)，這兩者都被認(rèn)為是促進(jìn)炎癥的。已有研究報(bào)道CASP1和GSDMD (蛋白D)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，這可能對(duì)許多細(xì)菌有保護(hù)作用。然而，體內(nèi)炎癥小體信號(hào)的過(guò)度激活和焦亡可能對(duì)宿主有害。在作者的研究中，作者觀察到IL1B濃度越高，細(xì)胞焦亡率越高，而細(xì)菌數(shù)量越多。

Fig 2 FLT4在清除鼠傷寒桿菌過(guò)程中保護(hù)巨噬細(xì)胞免遭細(xì)胞凋亡。

3.     FLT4抑制炎癥小體和CASP1的激活鼠鼠傷寒桿菌感染巨噬細(xì)胞

在炎性小體組裝過(guò)程中，成熟IL1B的釋放需要CASP1激活來(lái)切割前體pro-IL1B。炎性小體激活的另一個(gè)信號(hào)是PYCARD/ASC (PYD和CARD結(jié)構(gòu)域包含/凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白包含CARD)斑點(diǎn)的形成，它是CASP1激活的平臺(tái)。作者發(fā)現(xiàn)在flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細(xì)胞中形成了較高比例的PYCARD斑點(diǎn)(Figure 3A)。與傷寒沙門氏菌感染的Flt4WT/ WT相比，檢測(cè)對(duì)照細(xì)胞的蛋白質(zhì)齊聚狀態(tài)(Figure 3B)。結(jié)果表明，F(xiàn)LT4信號(hào)通路抑制細(xì)菌感染后巨噬細(xì)胞PYCARD斑點(diǎn)的形成。

接下來(lái)，作者測(cè)量了FLT4如何影響CASP1的激活。CASP1是一種關(guān)鍵酶，它能切割前il1b /白介素-1β蛋白轉(zhuǎn)化為活性IL1B。CASP1與炎性小體一起能誘導(dǎo)其自催化活性和自裂解，從而產(chǎn)生催化活性亞基CASP1 / p10及CASP1 / p20。與對(duì)照組細(xì)胞相比，感染沙門氏菌之后， flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細(xì)胞顯示出CASP1以CASP1/p20裂解表達(dá)形式增加(Figure 3C)。同樣，感染沙門氏菌之后， 激酶死亡突變體Flt4WT/TKmut或FLT4的敲除顯著增強(qiáng)了CASP1/p10的裂解形式(Figure 3D, E)。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)LT4信號(hào)通路抑制炎性小體的激活。

LPS啟動(dòng)傷寒沙門氏菌感染迅速誘導(dǎo)VEGFC蛋白表達(dá)(Figure 3F)。而外源性VEGFC可以降低Flt4WT/WT巨噬細(xì)胞中CASP1的激活(Figure 3G)。而FLT4抑制劑則增強(qiáng)了Flt4WT/WT巨噬細(xì)胞中CASP1的活化(Figure 3H)。使用外源性VEGFC和FLT4抑制劑的治療并沒(méi)有進(jìn)一步影響flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細(xì)胞中CASP1的激活(Figure 3G, H)。這些結(jié)果說(shuō)明在傷寒鏈球菌感染的巨噬細(xì)胞中，F(xiàn)LT4信號(hào)通路的激活抑制了炎癥小體觸發(fā)的PYCARD斑點(diǎn)的形成和CASP1激活。

Fig 3 FLT4抑制鼠傷寒桿菌感染巨噬細(xì)胞的炎癥小體和CASP1的激活

4.     FLT4以自噬依賴的方式增強(qiáng)細(xì)菌消除和防止炎性小體激活

在巨噬細(xì)胞識(shí)別病原體或吞噬細(xì)胞質(zhì)細(xì)菌的過(guò)程中，MAP1LC3以胞質(zhì)形式與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成MAP1LC3-磷脂酰乙醇胺結(jié)合物(MAP1LC3 -II)，它被招募到吞噬細(xì)胞膜上。成熟后，自噬體與溶酶體融合，降解和清除入侵的病原體，這也被稱為自噬體。作者通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)菌降解野生型巨噬細(xì)胞顯示邊緣不規(guī)則 (Figure 4A)。

自噬酶體形成的過(guò)程涉及到吞噬體和自噬機(jī)制的組成部分。因此作者用免疫印跡法測(cè)量了鼠傷寒桿菌感染野生型或flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中的MAP1LC3-I和MAP1LC3-II水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寒沙門氏菌感染提高了野生型巨噬細(xì)胞中MAP1LC3-II:MAP1LC3-I的比值，而flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中MAP1LC3-II水平顯著降低(Figure 4B)。 在永生化小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（iBMDM）細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FLT4或外源性VEGFC處理均提高了MAP1LC3-II水平(Figure 4C, D)。此外，用FLT4抑制劑或自噬藥物抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Ma)處理降低了MAP1LC3-II水平(Figure 4E, F)。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)LT4信號(hào)通路以map1lc3依賴的方式增強(qiáng)了自溶酶體的形成。與Flt4 WT/WT 巨噬細(xì)胞相比，flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中MAP1LC3點(diǎn)下降，與免疫印跡結(jié)果一致。此外，flt4?LBD/?LBD BMDMs顯示出LAMP1與MAP1LC3共定位的百分比下降。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)LT可以促進(jìn)吞噬-溶酶體的成熟(Figure 4G)。為進(jìn)一步確定FLT4信號(hào)通路是否增強(qiáng)自噬溶酶體的形成，通過(guò)巴弗洛霉素a1處理Flt4WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞來(lái)阻斷自噬溶酶體融合，然后轉(zhuǎn)染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與flt4WT/WT巨噬細(xì)胞相比，flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中SQSTM1/p62 蛋白水平表達(dá)量增加。這表明FLT4參與了自噬溶酶體形成的調(diào)控(Figure 4H)。

由于作者觀察到寒鏈球菌感染后，F(xiàn)LT4同時(shí)影響巨噬細(xì)胞的自噬和炎癥小體激活，作者進(jìn)一步探索自噬是否可以調(diào)節(jié)炎癥小體激活。作者使用自噬抑制劑3-MA治療傷寒鏈球菌感染的巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寒鏈球菌在Flt4WT/WT巨噬細(xì)胞中的清除水平與在Flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中的清除水平相似(Figure 4I)。此外，3-MA治療顯著增加了成熟IL1B的分泌(Figure 4J)，并且增加了CASP的裂解(Figure 4k)。此外，野生型和flt4?LBD/?LBD感染巨噬細(xì)胞后，3-MA處理可產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的胞內(nèi)寒鏈球菌，同時(shí)也消除了成熟IL1B分泌、PYCARD寡聚和CASP1激活(Figure 4J-K）?？偟膩?lái)說(shuō)，作者已經(jīng)闡明了FLT4以自噬機(jī)制依賴的方式增強(qiáng)了細(xì)菌的消除并減弱了過(guò)度的炎癥小體激活。

Fig 4 FLT4以自噬依賴的方式增強(qiáng)細(xì)菌消除和防止炎性小體激活

5.     FLT4與AMPK相互作用以協(xié)調(diào)糖代謝重編程、自噬和炎癥小體激活

FLT4是細(xì)胞表面的一種酪氨酸激酶受體，研究其酪氨酸激酶活性如何對(duì)其靶向下游效應(yīng)物調(diào)節(jié)自噬和炎癥小體激活的能力至關(guān)重要。為了識(shí)別新的結(jié)合部分，作者在RAW264.7細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)FLT4，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。作者根據(jù)它們潛在的酪氨酸修飾位點(diǎn)和與自噬的功能相關(guān)性確定了11個(gè)潛在的靶蛋白。采用免疫沉淀法確定FLT4和這些候選基因之間的相互作用，其中RKAA1 / AMPKα1(蛋白激酶,
amp激活，α 1催化亞基)與HEK293細(xì)胞中的FLT4相互免疫沉淀(Figure 5A)。此外，在RAW264.7細(xì)胞中，F(xiàn)LT4與PRKAA1對(duì)傷寒沙門氏菌感染的反應(yīng)增強(qiáng)(Figure 5B)。沙門氏菌感染增強(qiáng)了PRKAA1磷酸化(p-PRKAA1)水平和MAP1LC3脂化(MAP1LC3-II)水平，這種效果通過(guò)Flt4抑制劑的治療顯著降低(Figure 5C)。相比之下，F(xiàn)LT4抑制劑未能進(jìn)一步減弱FLT4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞的這些效應(yīng)(Figure 5C)。

作者接下來(lái)評(píng)估了FLT4是否通過(guò)AMPK減少自噬。感染沙門氏菌后，flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中p-PRKAA1、p-ULK1(Ser555)和MAP1LC3 脂化作用降低 (Figure 5D)。有趣的是，藥物AMPK激活劑AICAR(5-氨基酰亞胺-唑-4-carboxamide核糖核苷)治療顯著提高了flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞的p-ULK1、p-PRKAA1和MAP1LC3脂化水平，達(dá)到了與flt4 WT/WT巨噬細(xì)胞相似的程度(Figure 5D)。這表明激活的AMPK是FLT4信號(hào)通路調(diào)控自噬的下游效應(yīng)因子。此外,敲低PRKAA1降低ULK1水平和UMAP1LC3脂化水平，以及flt4WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞的MAP1LC3脂化程度，與感染后的Flt4 WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞相似 (Figure 5E)。此外，使用AMPK激動(dòng)劑AICAR顯著抑制成熟IL1B的產(chǎn)生，這表明AMPK抑制炎性小體激活(Figure 5F)。同樣的，AICAR 處理后，成熟Flt4WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中IL1B和胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌感染情況接近(Figure 5F，G),這些數(shù)據(jù)表明AMPK是FLT4在炎癥小體激活和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌自噬消除中的下游靶點(diǎn)。

由于作者觀察到AMPK激動(dòng)劑可以逆轉(zhuǎn)flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)自噬和炎癥小體激活中的表型，接下來(lái)進(jìn)一步探討FLT4是否通過(guò)下游AMPK調(diào)控葡萄糖代謝。作者在感染時(shí)通過(guò)AMPK激活了flt4 WT/WT和flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞中的AMPK(Figure 5H)，靜息狀態(tài)下，flt4WT/WT和flt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞顯示出相似的葡萄糖代謝產(chǎn)物。細(xì)菌感染后，與flt4WT/WT巨噬細(xì)胞相比，F(xiàn)lt4?LBD/?LBD巨噬細(xì)胞顯示NADH/NAD 和 NADPH/NADP 水平顯著降低。但提高乳酸和琥珀酸水平。這些數(shù)據(jù)共同表明，F(xiàn)LT4和AMPK在巨噬細(xì)胞中共同作用，重新編程糖酵解代謝，這與炎癥小體激活和自噬有關(guān)。

FIG 5.FLT4與AMPK相互作用以協(xié)調(diào)糖代謝重編程、自噬和炎癥小體激活

6.     flt4誘導(dǎo)的PRKAA1酪氨酸磷酸化對(duì)自噬和炎癥小體的激活是必不可少的

接下來(lái)，作者研究了PRKAA1中的哪些酪氨酸可以被酪氨酸激酶受體FLT4磷酸化。FLT4過(guò)表達(dá)促進(jìn)了PRKAA1酪氨酸磷酸化(Figure 6A)。根據(jù)UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)譜分析結(jié)果，作者確定了PRKAA1中5個(gè)可能的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，包括Y247 (A1)、Y294 (A2)、Y441/442 (A3)和Y500 (A5)，作者在每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了了苯丙氨酸點(diǎn)突變(Fig 6B)，并將它們分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞。與野生型對(duì)照(A0)相比，A1和A3突變可顯著降低MAP1LC3脂化(Fig 6C,D)。作者進(jìn)一步的通過(guò)PRKAA1突變過(guò)表達(dá)FLT4，發(fā)現(xiàn)A1和A3突變也顯著阻斷FLT4誘導(dǎo)MAP1LC3脂化(Fig 6D)。這些數(shù)據(jù)表明，Y247和Y441/442的磷酸化在PRKAA1在自噬中起著至關(guān)重要的作用。

為進(jìn)一步確定PRKAA1酪氨酸在Y247和Y441/442位點(diǎn)磷酸化未知的功能，作者將野生型PRKAA1的 A1、A3突變穩(wěn)定表達(dá)到iBMDM中(Figure 6E)。在鼠傷寒桿菌感染后，A0 iBMDMs中PRKAA1和ULK1的磷酸化增加，而 A1或A3突變體的p-PRKAA1和p-ULK1水平顯著降低(Figure 6E）。與此一致的是，與GFP對(duì)照相比，PRKAA1過(guò)表達(dá)而非A1和A3突變體增強(qiáng)了細(xì)菌清除率(Figure 6G),

為了確定PRKAA1是否也能調(diào)節(jié)炎癥小體的激活，作者用鼠傷寒桿菌感染了表達(dá)PRKAA1或A1或A3突變體的iBMDM。作者發(fā)現(xiàn)PRKAA1過(guò)表達(dá)減少了成熟巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL1B，但A3突變體(Y441/442 F)未顯示抑制作用(Figure 6H).

FIG 6 flt4誘導(dǎo)的PRKAA1酪氨酸磷酸化對(duì)自噬和炎癥小體的激活是必不可少的

FIG 7 flt4-AMPK調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞糖酵解代謝，以協(xié)調(diào)細(xì)菌感染期間的自噬、焦亡和炎癥小體激活。

綜上所述，作者的首次發(fā)現(xiàn)提出flt 4磷酸化PRKAA1中的Y247和Y441/442對(duì)糖酵解重編程、細(xì)菌清除和炎癥小體激活至關(guān)重要(Figure 7)。

參考文獻(xiàn)：
Ma, L., et al., FLT4/VEGFR3 activates AMPK to coordinate glycometabolic reprogramming with autophagy and inflammasome activation for bacterial elimination. Autophagy, 2021: p. 1-16.