阿爾茨海默?。?/span>AD),即老年癡呆,是最常見的神經(jīng)退行性疾病,目前尚無有效的治療方法。關(guān)于AD的機(jī)制和治療靶點(diǎn)的主流研究主要集中在兩個(gè)最重要的特征,Aβ和Tau,但臨床研究的結(jié)果并不令人鼓舞。小膠質(zhì)細(xì)胞異常極化是AD進(jìn)展過程中一個(gè)明顯的典型病理特征。小膠質(zhì)細(xì)胞通過降解和去除Aβ和Tau蛋白具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而,在AD條件下,小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促炎表型,降低小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性,損傷神經(jīng)元,促進(jìn)AD的病理。作者之前報(bào)道miR-146a多態(tài)性與零星AD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),鼻給藥miR-146a模擬物可減少AD的認(rèn)知障礙和主要病理特征。然而,miR-146a通過何種機(jī)制抵抗AD的病理過程尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中,小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)可以減少學(xué)習(xí)和記憶的認(rèn)知缺陷,減輕神經(jīng)炎癥,降低Aβ水平,改善斑塊相關(guān)的神經(jīng)炎病理,并防止神經(jīng)元丟失。本文于2021年11月發(fā)表在《Theranostics》IF:11.556期刊上。
技術(shù)路線:
主要結(jié)果:
1、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)改善APP/PS1 Tg小鼠的學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知缺陷
通過立體定位技術(shù)將腺相關(guān)病毒小膠質(zhì)細(xì)胞miR-146a (AAV-M146a)注射至10月齡APP/PS1 Tg小鼠雙側(cè)海馬,評價(jià)其對AD潛在的治療作用(Figure 1A)。注射一個(gè)月之后檢測miR-146a是否在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)。IF結(jié)果顯示APP/PS1-AAV-M146a組內(nèi)源性miR-146a與Iba1共定位在海馬但不與NeuN或GFAP發(fā)生共定位(Figure 1B),隨后RT-qPCR顯示miR-146a在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。以上表明miR-146a過表達(dá)AD小鼠構(gòu)建成功。
隨后用水迷宮(MWM)和物體識(shí)別測試(ORT)判斷小鼠的認(rèn)知能力。在ORT實(shí)驗(yàn)中,miR-146a過表達(dá)組小鼠具有更好的認(rèn)知行為表現(xiàn)(Figure 1D-E),在MWM實(shí)驗(yàn)中,miR-146a過表達(dá)組小鼠也表現(xiàn)出顯著增加運(yùn)動(dòng)軌跡和較短的逃避潛伏期(Figure 1F-G),穿越平臺(tái)的次數(shù)和目標(biāo)象限的游泳距離也顯著增加(Figure 1H-J)。這些結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a減輕AD小鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知缺陷。
圖1小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)改善APP/PS1 Tg小鼠的學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知缺陷
2、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經(jīng)炎癥和轉(zhuǎn)換小膠質(zhì)極化
作為小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)免疫響應(yīng),神經(jīng)炎癥過程在AD發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要作用,因而檢測了典型的炎癥因子的水平。結(jié)果顯示,miR-146a過表達(dá)顯著減低了炎癥因子的表達(dá),包括IL-1β, TNF-α, and IL-6 (Figure 2A),并且顯著增加了小膠質(zhì)細(xì)胞M2標(biāo)志物的表達(dá)Arg1, IL-10, CD206, and TGF-β (Figure 2B),而促炎因子和M1標(biāo)志物則顯著下調(diào)(Figure 2C);小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1的蛋白表達(dá)顯著增加(Figure 2D-E);MFG-E8蛋白表達(dá)水平無明顯變化(Figure 2F),但其mRNA水平升高(Figure 2G)。還檢測了斑塊相關(guān)CD68的水平,這是小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的標(biāo)志,發(fā)現(xiàn) miR-146a過表達(dá)后其表達(dá)顯著增加。以上結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經(jīng)炎癥和轉(zhuǎn)換小膠質(zhì)極化。
圖2小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經(jīng)炎癥和轉(zhuǎn)換小膠質(zhì)極化
3、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊
Aβ是AD的經(jīng)典病理特征之一,AD中小膠質(zhì)細(xì)胞的極化與Aβ的吞噬作用密切相關(guān)。海馬Aβ與Aβ42抗體染色顯示APP/PS1-AAV-M146a組與APP/PS1-AAV-Mcon組相比,Aβ顯著降低(Figure 3A)。然后用ELISA法檢測全腦裂解液中可溶性和不可溶性Aβ的含量,發(fā)現(xiàn)不可溶性Aβ40和Aβ42都顯著下降,而可溶性的則無明顯改變(Figure 3B-E)。用Thios染色檢測斑塊形成,結(jié)果表明過表達(dá)miR-146a之后Thios的數(shù)量顯著下降。以上結(jié)果提示小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊。
圖3小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊
4、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)降低AD小鼠斑塊相關(guān)神經(jīng)炎病理和神經(jīng)元丟失
此前有研究報(bào)道AD患者和小鼠模型中神經(jīng)突營養(yǎng)不良與Aβ沉積密切相關(guān),而AD小鼠模型中miR-146a過表達(dá)是否減輕了這一表型尚未被研究。發(fā)現(xiàn)與對照相比,過表達(dá)miR-146a后,抗APP的N末端抗體標(biāo)記損傷的神經(jīng)突,顯示營養(yǎng)不良的神經(jīng)突顯著減少(Figure 4A–B);海馬和皮質(zhì)中神經(jīng)元數(shù)量增加(Figure 4C–E);凋亡的神經(jīng)元數(shù)量減少(Figure 4G–H)。以上結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)降低AD小鼠斑塊相關(guān)神經(jīng)炎病理和神經(jīng)元丟失。
圖4小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)降低AD小鼠斑塊相關(guān)神經(jīng)炎病理和神經(jīng)元丟失
5、在Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中,miR-146a水平升高觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換
在證實(shí)miR-146a過表達(dá)在體內(nèi)將小膠質(zhì)細(xì)胞從M1轉(zhuǎn)化為M2后,進(jìn)一步在體外證實(shí)這些結(jié)果,并試圖確定miR-146a與小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Aβ42誘導(dǎo)下,過表達(dá)miR-146a后,由M1表型小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子TNF-α, IL-1β, and IL-6的水平都顯著下降(Figure 5A–B);相反的,M2極化標(biāo)志物和抗炎因子都顯著升高(Figure 5C)。在Aβ42誘導(dǎo)下,與對照抑制劑組相比,miR-146a抑制劑組TNF-α、IL-1β和IL-6均未明顯下降(Figure 5D–E)。Arg1 or TGF-β的水平也未觀察到明顯下降(Figure 5F)。這些結(jié)果表明miR-146a在Aβ42誘導(dǎo)下可觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞降低促炎表型,增強(qiáng)吞噬表型。
圖5-1在Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中,miR-146a水平升高觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞表型開關(guān)
6、在Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中,miR-146a水平升高增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用
隨后,探究miR-146a過表達(dá)能否提高小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用。Aβ42處理的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出變形蟲表型,其面積、Feret直徑和周長均顯著高于對照組,而Aβ42誘導(dǎo)前小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-146a水平過表達(dá)時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形或梭形,面積、Feret直徑和周長均較NC模擬組降低(Figure 5G–J)。相反,當(dāng)在Aβ42誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥前抑制miR-146a的表達(dá),與模擬NC組相比,小膠質(zhì)細(xì)胞面積、Feret直徑和周長均無明顯降低(Figure 5N–Q)。此外,使用聚苯乙烯微球來評估小膠質(zhì)細(xì)胞的一般吞噬活性,并確保測量的是吞噬作用而不是胞飲作用,結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-146a過表達(dá)組的吞噬活性顯著增強(qiáng)(Figure 5K),而miR-146a抑制劑的小膠質(zhì)細(xì)胞在Aβ42誘導(dǎo)的吞噬活性下表現(xiàn)出不顯著的吞噬活性(Figure 5R)。此外,還檢測了MFG-E8,這是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的關(guān)鍵因子,結(jié)果顯示Aβ42刺激后MFG-E8水平無明顯變化,但miR-146a模擬物使其水平升高(Figure 5L–M)。因此,這些結(jié)果表明在Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中,miR-146a水平升高增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用。
圖5-2在Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中,miR-146a水平升高增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用
7、miR-146a水平升高阻礙Aβ42或LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡
為了確定miR-146a是否能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型,從而減少神經(jīng)元損傷,首先在體外用miR-146a模擬物或抑制劑處理HMC3細(xì)胞,然后加入Aβ42激活小膠質(zhì)細(xì)胞。反過來,以1:1的比例直接共培養(yǎng)HMC3和SH-SY5Y細(xì)胞,以評估神經(jīng)元凋亡(Figure 6A–B)。流式結(jié)果顯示當(dāng)Aβ42作用于HMC-3細(xì)胞時(shí),SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率升高(Figure 6C–D)。然而,miR-146a過表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率在Aβ42刺激下下降(Figure 6C,E);miR-146a抑制劑處理則相反(Figure 6D,F)。這些結(jié)果說明miR-146a水平升高阻礙Aβ42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。
圖6 miR-146a水平升高阻礙Aβ42或LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡
8、鑒定到小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)miR-146a的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥相關(guān)基因特征
為了探討小膠質(zhì)細(xì)胞miR-146a過表達(dá)對AD代謝通路的影響,特別是對神經(jīng)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的影響,分析了APP/PS1-AAV-M146a和APP/PS1-AAV-Mcon小鼠的大腦樣本的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)(Figure 7A)。如Figure 7B所示,幾個(gè)炎癥相關(guān)基因,如Oas1g、CD36和Cxcl10,均在上調(diào)量最高的基因中,表明miR-146a在神經(jīng)炎癥中起著中心作用。自組織映射(SOM)聚類也確定了參與神經(jīng)炎癥的基因(Figure 7C)。將這些基因按照APP/PS1-AAV-M146a和APP/PS1-AAV-Mcon小鼠組的表達(dá)水平進(jìn)行分組。APP/PS1-AAVM146a小鼠組高表達(dá)基因的GSEA顯示其在神經(jīng)元凋亡過程和免疫系統(tǒng)過程負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程中富集(Figure 7E),而AD對照組小鼠組則表現(xiàn)為凋亡過程(Figure 7D)。KEGG顯示差異表達(dá)基因主要富集在“immune response”, “immune system process”,“defense response”, and “cell response to interferon”通路(Figure 7G) ,提示miR-146a在AD的發(fā)展過程中對免疫應(yīng)答具有重要作用。
圖7鑒定到小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)miR-146a的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥相關(guān)基因特征
綜上所述,本文報(bào)道了小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a過表達(dá)可能是一種新的有價(jià)值的AD治療方法。在APP/PS1 Tg小鼠中,高水平的小膠質(zhì)細(xì)胞特異性miR-146a表達(dá)可減少學(xué)習(xí)和記憶的認(rèn)知障礙,減輕神經(jīng)炎癥,降低Aβ水平,并防止神經(jīng)元丟失。值得注意的是,miR-146a已被證明能增加AD條件下的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,降低促炎表型,增加吞噬表型,并保護(hù)神經(jīng)元。本文結(jié)果為miR-146a是AD和其他小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)疾病的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)提供了證據(jù)。
參考文獻(xiàn):
Liang Chunmei., Zou Ting., Zhang Miaoping., Fan Weihao., Zhang Tianzhen., Jiang Yuling., Cai Yujie., Chen Feng., Chen Xiongjin., Sun Yuanhong., Zhao Bin., Wang Yan., Cui Lili.(2021). MicroRNA-146a switches microglial phenotypes to resist the pathological processes and cognitive degradation of Alzheimer's disease. Theranostics, 11(9), 4103-4121. doi:10.7150/thno.53418