miR-146a有望治療老年癡呆

阿爾茨海默病（AD），即老年癡呆，是最常見的神經(jīng)退行性疾病，目前尚無有效的治療方法。關于AD的機制和治療靶點的主流研究主要集中在兩個最重要的特征，Aβ和Tau，但臨床研究的結(jié)果并不令人鼓舞。小膠質(zhì)細胞異常極化是AD進展過程中一個明顯的典型病理特征。小膠質(zhì)細胞通過降解和去除Aβ和Tau蛋白具有神經(jīng)保護作用。然而，在AD條件下，小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為促炎表型，降低小膠質(zhì)細胞的吞噬活性，損傷神經(jīng)元，促進AD的病理。作者之前報道miR-146a多態(tài)性與零星AD風險相關，鼻給藥miR-146a模擬物可減少AD的認知障礙和主要病理特征。然而，miR-146a通過何種機制抵抗AD的病理過程尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中，小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達可以減少學習和記憶的認知缺陷，減輕神經(jīng)炎癥，降低Aβ水平，改善斑塊相關的神經(jīng)炎病理，并防止神經(jīng)元丟失。本文于2021年11月發(fā)表在《Theranostics》IF：11.556期刊上。

技術路線：

主要結(jié)果：

1、小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達改善APP/PS1 Tg小鼠的學習和記憶認知缺陷

通過立體定位技術將腺相關病毒小膠質(zhì)細胞miR-146a (AAV-M146a)注射至10月齡APP/PS1 Tg小鼠雙側(cè)海馬，評價其對AD潛在的治療作用(Figure 1A)。注射一個月之后檢測miR-146a是否在小膠質(zhì)細胞中特異性表達。IF結(jié)果顯示APP/PS1-AAV-M146a組內(nèi)源性miR-146a與Iba1共定位在海馬但不與NeuN或GFAP發(fā)生共定位(Figure 1B)，隨后RT-qPCR顯示miR-146a在小膠質(zhì)細胞中高表達。以上表明miR-146a過表達AD小鼠構(gòu)建成功。

隨后用水迷宮（MWM）和物體識別測試（ORT）判斷小鼠的認知能力。在ORT實驗中，miR-146a過表達組小鼠具有更好的認知行為表現(xiàn)（Figure 1D-E），在MWM實驗中，miR-146a過表達組小鼠也表現(xiàn)出顯著增加運動軌跡和較短的逃避潛伏期（Figure 1F-G），穿越平臺的次數(shù)和目標象限的游泳距離也顯著增加（Figure 1H-J）。這些結(jié)果表明小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a減輕AD小鼠模型的學習和記憶認知缺陷。

圖1小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達改善APP/PS1 Tg小鼠的學習和記憶認知缺陷

2、小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經(jīng)炎癥和轉(zhuǎn)換小膠質(zhì)極化

作為小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)免疫響應，神經(jīng)炎癥過程在AD發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要作用，因而檢測了典型的炎癥因子的水平。結(jié)果顯示，miR-146a過表達顯著減低了炎癥因子的表達，包括IL-1β, TNF-α, and IL-6 (Figure 2A)，并且顯著增加了小膠質(zhì)細胞M2標志物的表達Arg1, IL-10, CD206, and TGF-β (Figure 2B)，而促炎因子和M1標志物則顯著下調(diào)(Figure 2C)；小膠質(zhì)細胞標志物Iba1的蛋白表達顯著增加（Figure 2D-E）；MFG-E8蛋白表達水平無明顯變化(Figure 2F)，但其mRNA水平升高(Figure 2G)。還檢測了斑塊相關CD68的水平，這是小膠質(zhì)細胞吞噬活性的標志，發(fā)現(xiàn) miR-146a過表達后其表達顯著增加。以上結(jié)果表明小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經(jīng)炎癥和轉(zhuǎn)換小膠質(zhì)極化。

圖2小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經(jīng)炎癥和轉(zhuǎn)換小膠質(zhì)極化

3、小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊

Aβ是AD的經(jīng)典病理特征之一，AD中小膠質(zhì)細胞的極化與Aβ的吞噬作用密切相關。海馬Aβ與Aβ₄₂抗體染色顯示APP/PS1-AAV-M146a組與APP/PS1-AAV-Mcon組相比，Aβ顯著降低（Figure 3A）。然后用ELISA法檢測全腦裂解液中可溶性和不可溶性Aβ的含量，發(fā)現(xiàn)不可溶性Aβ₄₀和Aβ₄₂都顯著下降，而可溶性的則無明顯改變（Figure 3B-E）。用Thios染色檢測斑塊形成，結(jié)果表明過表達miR-146a之后Thios的數(shù)量顯著下降。以上結(jié)果提示小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊。

圖3小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊

4、小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠斑塊相關神經(jīng)炎病理和神經(jīng)元丟失

此前有研究報道AD患者和小鼠模型中神經(jīng)突營養(yǎng)不良與Aβ沉積密切相關，而AD小鼠模型中miR-146a過表達是否減輕了這一表型尚未被研究。發(fā)現(xiàn)與對照相比，過表達miR-146a后，抗APP的N末端抗體標記損傷的神經(jīng)突，顯示營養(yǎng)不良的神經(jīng)突顯著減少（Figure 4A–B）；海馬和皮質(zhì)中神經(jīng)元數(shù)量增加（Figure 4C–E）；凋亡的神經(jīng)元數(shù)量減少（Figure 4G–H）。以上結(jié)果表明小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠斑塊相關神經(jīng)炎病理和神經(jīng)元丟失。

圖4小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠斑塊相關神經(jīng)炎病理和神經(jīng)元丟失

5、在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高觸發(fā)小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)換

在證實miR-146a過表達在體內(nèi)將小膠質(zhì)細胞從M1轉(zhuǎn)化為M2后，進一步在體外證實這些結(jié)果，并試圖確定miR-146a與小膠質(zhì)細胞炎癥反應之間的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Aβ₄₂誘導下，過表達miR-146a后，由M1表型小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的促炎因子TNF-α, IL-1β, and IL-6的水平都顯著下降(Figure 5A–B)；相反的，M2極化標志物和抗炎因子都顯著升高(Figure 5C)。在Aβ₄₂誘導下，與對照抑制劑組相比，miR-146a抑制劑組TNF-α、IL-1β和IL-6均未明顯下降(Figure 5D–E)。Arg1 or TGF-β的水平也未觀察到明顯下降(Figure 5F)。這些結(jié)果表明miR-146a在A_β42誘導下可觸發(fā)小膠質(zhì)細胞降低促炎表型，增強吞噬表型。

圖5-1在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高觸發(fā)小膠質(zhì)細胞表型開關

6、在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高增強小膠質(zhì)細胞吞噬作用

隨后，探究miR-146a過表達能否提高小膠質(zhì)細胞的吞噬作用。Aβ₄₂處理的小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出變形蟲表型，其面積、Feret直徑和周長均顯著高于對照組，而Aβ₄₂誘導前小膠質(zhì)細胞內(nèi)miR-146a水平過表達時，小膠質(zhì)細胞呈圓形或梭形，面積、Feret直徑和周長均較NC模擬組降低(Figure 5G–J)。相反，當在Aβ₄₂誘導神經(jīng)炎癥前抑制miR-146a的表達，與模擬NC組相比，小膠質(zhì)細胞面積、Feret直徑和周長均無明顯降低(Figure 5N–Q)。此外，使用聚苯乙烯微球來評估小膠質(zhì)細胞的一般吞噬活性，并確保測量的是吞噬作用而不是胞飲作用，結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-146a過表達組的吞噬活性顯著增強(Figure 5K)，而miR-146a抑制劑的小膠質(zhì)細胞在Aβ₄₂誘導的吞噬活性下表現(xiàn)出不顯著的吞噬活性(Figure 5R)。此外，還檢測了MFG-E8，這是介導巨噬細胞吞噬凋亡細胞的關鍵因子，結(jié)果顯示Aβ₄₂刺激后MFG-E8水平無明顯變化，但miR-146a模擬物使其水平升高(Figure 5L–M)。因此，這些結(jié)果表明在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高增強小膠質(zhì)細胞吞噬作用。

圖5-2在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高增強小膠質(zhì)細胞吞噬作用

7、miR-146a水平升高阻礙Aβ₄₂或LPS誘導的神經(jīng)元凋亡

為了確定miR-146a是否能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的表型，從而減少神經(jīng)元損傷，首先在體外用miR-146a模擬物或抑制劑處理HMC3細胞，然后加入A_β42激活小膠質(zhì)細胞。反過來，以1:1的比例直接共培養(yǎng)HMC3和SH-SY5Y細胞，以評估神經(jīng)元凋亡(Figure 6A–B)。流式結(jié)果顯示當A_β42作用于HMC-3細胞時，SH-SY5Y細胞凋亡率升高(Figure 6C–D)。然而，miR-146a過表達SH-SY5Y細胞的凋亡率在Aβ₄₂刺激下下降(Figure 6C，E)；miR-146a抑制劑處理則相反(Figure 6D，F)。這些結(jié)果說明miR-146a水平升高阻礙Aβ₄₂誘導的神經(jīng)元凋亡。

圖6 miR-146a水平升高阻礙Aβ₄₂或LPS誘導的神經(jīng)元凋亡

8、鑒定到小膠質(zhì)細胞過表達miR-146a的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥相關基因特征

為了探討小膠質(zhì)細胞miR-146a過表達對AD代謝通路的影響，特別是對神經(jīng)炎癥相關信號通路的影響，分析了APP/PS1-AAV-M146a和APP/PS1-AAV-Mcon小鼠的大腦樣本的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)(Figure 7A)。如Figure 7B所示，幾個炎癥相關基因，如Oas1g、CD36和Cxcl10，均在上調(diào)量最高的基因中，表明miR-146a在神經(jīng)炎癥中起著中心作用。自組織映射(SOM)聚類也確定了參與神經(jīng)炎癥的基因(Figure 7C)。將這些基因按照APP/PS1-AAV-M146a和APP/PS1-AAV-Mcon小鼠組的表達水平進行分組。APP/PS1-AAVM146a小鼠組高表達基因的GSEA顯示其在神經(jīng)元凋亡過程和免疫系統(tǒng)過程負調(diào)控等生物學過程中富集(Figure 7E)，而AD對照組小鼠組則表現(xiàn)為凋亡過程(Figure 7D)。KEGG顯示差異表達基因主要富集在“immune response”, “immune system process”,“defense response”, and “cell response to interferon”通路(Figure 7G) ，提示miR-146a在AD的發(fā)展過程中對免疫應答具有重要作用。

圖7鑒定到小膠質(zhì)細胞過表達miR-146a的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥相關基因特征

綜上所述，本文報道了小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a過表達可能是一種新的有價值的AD治療方法。在APP/PS1 Tg小鼠中，高水平的小膠質(zhì)細胞特異性miR-146a表達可減少學習和記憶的認知障礙，減輕神經(jīng)炎癥，降低Aβ水平，并防止神經(jīng)元丟失。值得注意的是，miR-146a已被證明能增加AD條件下的小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，降低促炎表型，增加吞噬表型，并保護神經(jīng)元。本文結(jié)果為miR-146a是AD和其他小膠質(zhì)細胞相關疾病的一個有希望的靶點提供了證據(jù)。

參考文獻：

Liang Chunmei., Zou Ting., Zhang Miaoping., Fan Weihao., Zhang Tianzhen., Jiang Yuling., Cai Yujie., Chen Feng., Chen Xiongjin., Sun Yuanhong., Zhao Bin., Wang Yan., Cui Lili.(2021). MicroRNA-146a switches microglial phenotypes to resist the pathological processes and cognitive degradation of Alzheimer's disease. Theranostics, 11(9), 4103-4121. doi:10.7150/thno.53418