hsa_circ_0005358抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移是宮頸癌致死的主要原因，但迄今為止，還沒(méi)有有效的治療方法來(lái)阻止轉(zhuǎn)移。circRNAs被發(fā)現(xiàn)與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。在本研究中，我們?cè)趯m頸癌組織中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來(lái)自宿主基因Gli1的表達(dá)下調(diào)的circRNA (hsa_ circ_0005358)，該circRNA在有頸外轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)量低于無(wú)頸外轉(zhuǎn)移的組織。上調(diào)hsa_circ_0005358可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲，下調(diào)hsa_circ_0005358則相反。小鼠模型顯示過(guò)表達(dá)hsa_ circ_0005358的宮頸癌細(xì)胞在體內(nèi)具有較弱的轉(zhuǎn)移潛能。RNA下拉分析、質(zhì)譜分析和RNA免疫沉淀驗(yàn)證了hsa_circ_0005358通過(guò)其215-224序列發(fā)揮作用，該序列與PTBP1相互作用。RNA測(cè)序分析顯示，CDCP1是hsa_circ_0005358和PTBP1的共同靶點(diǎn)。我們進(jìn)一步證實(shí)，hsa_circ_0005358隔離了PTBP1，阻止其穩(wěn)定CDCP1 mRNA，減少CDCP1蛋白翻譯，最終抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。我們的研究結(jié)果揭示了hsa_ circ_0005358在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，這可能為轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者提供一種潛在的治療方法。本文于2021年11月發(fā)表于“Molecular Therapy: Nucleic Acids”（IF=8.886）。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）hsa_circ_0005358的識(shí)別和特征

在我們前期的研究中，對(duì)12份頸標(biāo)本進(jìn)行了circRNA測(cè)序分析(GEO: GSE147009)，其中包括6個(gè)正常宮頸組織和6個(gè)宮頸癌組織。測(cè)序結(jié)果顯示共有257個(gè)circRNA在宮頸癌組織中顯著下調(diào) (圖1A)。我們集中研究了宮頸癌組織中15個(gè)差異最大的下調(diào)circRNA?？紤]到hsa_circ_0005358是宮頸癌組織中表達(dá)最明顯的circRNA之一，且在不同的引物中特異性最大，我們選擇hsa_circ_0005358進(jìn)行進(jìn)一步研究?；蚪M結(jié)構(gòu)表明，hsa_circ_0005358是由人類(lèi)Gli1基因(chr12:57,861,115-57,862,007)生成的(圖1B)。我們利用SiHa和CaSki兩株宮頸癌細(xì)胞株的cDNA和gDNA進(jìn)行了PCR。如果沒(méi)有特定的環(huán)狀連接，當(dāng)使用發(fā)散性引物時(shí)，gDNA不能擴(kuò)增PCR產(chǎn)物(圖1C)。我們還設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物對(duì)全長(zhǎng)hsa_ circ_0005358進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)DNA凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證(圖1D)。在northern blot實(shí)驗(yàn)中，使用靶向特異性連接的探針在SiHa和CaSki細(xì)胞中檢測(cè)到了內(nèi)源性hsa_circ_0005358的表達(dá)(圖1E)。此外，RNase R處理后，其宿主基因的mRNA表達(dá)顯著減少，hsa_circ_0005358對(duì)RNase R消化具有抗性(圖1F)，這表明hsa_circ_0005358 RNA是一種穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RNA熒光原位雜交(FISH)(圖1G)和亞細(xì)胞分離試驗(yàn)(圖1H)顯示，hsa_ circ_0005358主要位于SiHa和CaSki細(xì)胞的細(xì)胞核中，但也存在于細(xì)胞質(zhì)中。綜上所述，hsa_circ_0005358在宮頸癌細(xì)胞中是一個(gè)穩(wěn)定的circRNA。

2）Hsa_circ_0005358在體內(nèi)外均可作為宮頸癌轉(zhuǎn)移行為的抑制因子

為了探究hsa_circ_0005358的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了一個(gè)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358的質(zhì)粒。采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358后，與對(duì)照細(xì)胞相比，SiHa和CaSki細(xì)胞的遷移和侵襲率均顯著降低(圖2A和2B)。傷口愈合檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)hsa_ circ_0005358可導(dǎo)致間隙閉合減慢(圖2C)。CCK-8檢測(cè)顯示hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)和不過(guò)表達(dá)的細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著差異(圖2D)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358的細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低并不是細(xì)胞增殖率降低的結(jié)果。

為了證實(shí)hsa_circ_0005358在體內(nèi)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，我們將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358或?qū)φ蛰d體的SiHa細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射到雌性SCID小鼠體內(nèi)，并利用體內(nèi)成像技術(shù)，每周通過(guò)發(fā)光監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移情況。我們發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005358在注射4周后，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358顯著抑制SiHa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(圖2E和2F)。H&E染色組織學(xué)顯示肺轉(zhuǎn)移灶的典型形態(tài)(圖2G)。hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)組的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于對(duì)照組(圖2H)。此外，與正常宮頸組織相比，hsa_circ_0005358在宮頸癌組織中明顯缺失，而宮頸外侵襲或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(FIGO II期或以上)的腫瘤樣本中hsa_ circ_0005358的表達(dá)量明顯低于宮頸腫瘤樣本(FIGO I期)(圖2I)。綜上所述，hsa_ circ_0005358是宮頸癌轉(zhuǎn)移的抑制因子。

3）hsa_circ_0005358直接與PTBP1相互作用

hsa_circ_0005358序列的生物信息學(xué)分析表明hsa_circ_0005358可能與RBP相互作用。為了探索hsa_circ_0005358的蛋白伴侶，我們進(jìn)行了RNA-pull-down分析。結(jié)果顯示在hsa_circ_0005358探針道中約55-70 kDa處有一條明顯的條帶(圖3A)。質(zhì)譜結(jié)果證實(shí)，該差異帶的主要成分為PTBP1，這是宮頸癌中上調(diào)的基因。western blot分析(圖3B)和RIP分析(圖3C)顯示hsa_circ_0005358和PTBP1之間存在相互作用。RNA-pull-down分析(圖3D)和RIP分析(圖3E)表明，hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)時(shí)，hsa_circ_0005358與PTBP1之間的相互作用更強(qiáng)。接著，我們利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了hsa_circ_0005358和PTBP1之間的5個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)，然后構(gòu)建了5個(gè)針對(duì)每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的突變circRNA質(zhì)粒(Mut1-Mut5)和另一個(gè)包含所有潛在突變結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒(Mut6)(圖3F)。這些突變都沒(méi)有影響hsa_circ_0005358的圓形結(jié)構(gòu)。如圖3 G和3 H，Mut1、Mut2和Mut3質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)顯著抑制了SiHa和CaSki細(xì)胞的遷移和侵襲，而Mut4、Mut5和Mut6則喪失了這種功能，說(shuō)明Mut4和Mut5所在的序列215-224是hsa_- circ_0005358功能所必需的。我們將序列215-224突變的hsa_circ_0005358質(zhì)粒命名為Mut-hsa_circ_0005358(圖3I)。RNA下拉分析顯示，PTBP1在SiHa和CaSki過(guò)表達(dá)Mut-hsa_circ_0005358的細(xì)胞中富集程度低于過(guò)表達(dá)野生型hsa_circ_0005358的細(xì)胞(圖3J)。RIP檢測(cè)和qRT-PCR顯示，Mut-hsa_circ_0005358不能被PTBP1捕獲(圖3K)。過(guò)表達(dá)Mut-hsa_circ_0005358的細(xì)胞表現(xiàn)出與對(duì)照細(xì)胞相似的遷移和侵襲能力(圖3L和3M)。我們的結(jié)果表明，hsa_circ_0005358通過(guò)序列215-224直接與PTBP1結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)功能。

4）hsa_circ_0005358通過(guò)與PTBP1結(jié)合調(diào)控CDCP1的表達(dá)

由于hsa_circ_0005358作為誘餌作用于PTBP1，我們對(duì)hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)/未過(guò)表達(dá)的SiHa細(xì)胞和PTBP1沉默/未沉默的SiHa細(xì)胞進(jìn)行了兩次 RNA-seq分析。RNA-seq分析獲得了99個(gè)RNA-seq-1的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本和6027個(gè)RNA-seq-2的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。RNA-seq-1和RNA-seq-2的重疊進(jìn)行了分析，并在聚類(lèi)熱圖中顯示(圖4A和圖4B)。重疊基因中，有38個(gè)在hsa_ circ_0005358過(guò)表達(dá)和PTBP1沉默的細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì)相似。我們根據(jù)報(bào)道的這些基因的功能，進(jìn)一步減少候選基因的數(shù)量，并選擇15個(gè)基因在SiHa和CaSki細(xì)胞中進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證(圖4C和4D)。LAMC2、CDCP1和SYTL2這三種mRNA的表達(dá)在過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358或沉默PTBP1的SiHa和CaSki細(xì)胞中均顯示出一致的變化趨勢(shì)(圖4E)。接下來(lái)，我們檢測(cè)了三種蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CDCP1蛋白在過(guò)表達(dá)hsa_circ_0005358或沉默PTBP1的SiHa和CaSki細(xì)胞中的表達(dá)量比其他兩種蛋白的表達(dá)量下降更明顯(圖4F)。結(jié)果提示hsa_circ_0005358和PTBP1共同調(diào)控CDCP1的表達(dá)。

我們同時(shí)在SiHa和CaSki細(xì)胞中上調(diào)hsa_circ_0005358和CDCP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)導(dǎo)致兩種細(xì)胞株的遷移和侵襲率降低，而CDCP1的上調(diào)抵消了這些影響(圖4G-4I)。此外，我們想知道hsa_circ_0005358是否以PTBP1依賴(lài)的方式調(diào)控CDCP1的表達(dá)。Mut-hsa_circ_0005358的過(guò)表達(dá)與CDCP1的表達(dá)水平類(lèi)似于載體組(圖4J)。結(jié)合Mut-hsa_circ_0005358的表型，如圖3L和3M所示，這些結(jié)果表明上調(diào)的hsa_circ_0005358通過(guò)與PTBP1結(jié)合抑制CDCP1的表達(dá)，從而減弱宮頸癌細(xì)胞的侵襲性轉(zhuǎn)移行為。

5）hsa_circ_0005358阻止PTBP1與CDCP1 mRNA結(jié)合并使其穩(wěn)定

考慮到在我們的RNA-seq分析中，PTBP1基因的下調(diào)抑制了CDCP1 mRNA的表達(dá)，而Clip-seq數(shù)據(jù)庫(kù)暗示PTBP1直接與CDCP1 mRNA結(jié)合，我們推斷，PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合可能增強(qiáng)了CDCP1 mRNA的穩(wěn)定性。下拉試驗(yàn)和RIP試驗(yàn)驗(yàn)證了在SiHa和CaSki細(xì)胞中PTBP1與CDCP1 mRNA結(jié)合(圖5A和5B)。接著，我們使用Act-D檢測(cè)SiHa和CaSki細(xì)胞中CDCP1 mRNA水平的衰減率。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在SiHa和CaSki細(xì)胞中，PTBP1基因下調(diào)加速了內(nèi)源性CDCP1 mRNA的降解，降低了CDCP1蛋白水平，而PTBP1基因上調(diào)則相反(圖5C和5D)。結(jié)果表明，PTBP1結(jié)合并穩(wěn)定CDCP1 mRNA，從而提高CDCP1蛋白的表達(dá)。下拉試驗(yàn)和RIP試驗(yàn)表明，hsa_circ_0005358的過(guò)表達(dá)，而不是Mut-hsa_circ_005358的過(guò)表達(dá)，減少了CDCP1 mRNA對(duì)PTBP1的招募(圖5E)，降低了PTBP1抗體富集的CDCP1 mRNA水平(圖5F)，表明hsa_circ_0005358阻斷了PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合。接下來(lái)我們檢測(cè)Act-D處理后不同條件下CDCP1 mRNA的表達(dá)情況。如圖5G和圖5H所示，hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)，而不是Mut-hsa_circ_0005358過(guò)表達(dá)，加速了CDCP1 mRNA的衰減和蛋白合成的減速，hsa_circ_0005358和PTBP1共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)。綜上所述，hsa_circ_0005358抑制了PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合和穩(wěn)定，從而降低了CDCP1蛋白水平。

結(jié)論：在宮頸癌中，circRNA hsa_-circ_0005358的恢復(fù)阻礙了PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合和穩(wěn)定，導(dǎo)致CDCP1下調(diào)和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，這可能為轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者提供一種潛在的治療方法。

參考文獻(xiàn)：Cen Y, Zhu T, Zhang Y, Zhao L, Zhu J, Wang L, Xu J, Ding T, Xie X, Wang X, Lu W. hsa_circ_0005358 suppresses cervical cancer metastasis by interacting with PTBP1 protein to destabilize CDCP1 mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Nov 29;27:227-240. doi: 10.1016/j.omtn.2021.11.020. PMID: 34976440; PMCID: PMC8693350.