心律失常性心肌病的潛在新療法：crenolanib藥物抑制PDGFRA

FLNC截斷突變（FLNCtv）是遺傳性擴(kuò)張型心肌?。?/span>DCM）的常見病因，是發(fā)展成心律失常性心肌病的高危因素。本研究結(jié)果表明，PDGFRA信號通路與DCM發(fā)病機(jī)制有關(guān)，抑制該通路可能是flnc相關(guān)心肌病的一種治療策略本研究于2022年2月發(fā)表在《Science Advances》IF:14.136雜志上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、使用患者特異性多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞（iPSC-CMs）構(gòu)建FLNC-相關(guān)DCM模型

作者從FLNC^G1891Vfs61X和FLNC^CE2189X的DCM患者身上分離出iPSC細(xì)胞，然后誘導(dǎo)成iPSC-CMs，并探究其電生理學(xué)屬性，結(jié)果顯示與健康對照組相比，FLNCtv患者的iPSC-CMs均表現(xiàn)出較弱的收縮性和較慢的放松性（Fig. 1 A and B）。兩種患者特異性iPSC-CMs也表現(xiàn)為自發(fā)性心律失常（Fig. 1 C）。與對照組iPSC-CMs相比，心律失常表型也表現(xiàn)為心率的較大變異（Fig. 1 D）。為了進(jìn)一步驗證心律失常的表型，檢測了健康和iPSC-CMs患者的動作電位(AP)形態(tài)。與收縮數(shù)據(jù)一致，40%的FLNC^G1891Vfs61X和36%的FLNC^CE2189X 的iPSC-CMs與對照iPSC-CMs相比出現(xiàn)異常AP形態(tài)（Fig. 1 E and F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，FLNC患者iPSC-CMs概述了體外與FLNC相關(guān)的DCM相關(guān)的心律失常表型。

圖1 FLNC^G1891Vfs61X and FLNC^E2189X iPSC-CMs 表現(xiàn)出收縮性受損和心律失常

2、FLNC^G1891Vfs61X和FLNC^CE2189X都是缺失突變體其導(dǎo)致FLNC相關(guān)心肌病的單倍機(jī)能不全

接下來檢測了患者特異性iPSC-CMs中FLNC的表達(dá)水平，通過免疫印跡和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組iPSC-CMs相比，FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X突變體表達(dá)FLNC蛋白和mRNA水平均顯著降低（Fig. 2 A to C）。盡管FLNC表達(dá)水平降低，但通過免疫熒光染色和共定位分析，能夠在兩個FLNC突變的iPSC-CM細(xì)胞系中檢測到FLNC及其與α- actitin在Z-discz盤的共定位（Fig. 2D）。

為了探究FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X是否是功能丟失的突變體，為FLNC缺失的iPSC系和等基因?qū)φ障导?xì)胞生成了差異表達(dá)基因(DEG)譜，并與iPSC- CMs患者的DEG譜進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示成功構(gòu)建了FLNC純合子（FLNCKO?/?）和雜合子（FLNCKO+/?）敲除的iPSC-CMs（Fig. 2 E to H）。FLNCKO?/?和FLNCKO+/?iPSC-CMs中FLNC的表達(dá)在mRNA和蛋白水平上均以等位基因依賴的方式顯著降低。RNA測序生物信息學(xué)分析顯示，F(xiàn)LNC截斷突變中的DEGs與FLNC KO iPSC-CMs中的DEGs呈正相關(guān)，支持功能缺失是FLNC突變引起表型表現(xiàn)的主要機(jī)制（Fig. 2I）。此外，攜帶FLNC突變的iPSC-CMs顯著降低了ID蛋白水平；FLNC KO iPSC-CMs也有相同的發(fā)現(xiàn)（Fig. 2J）。最后，F(xiàn)LNCKO?/?細(xì)胞表現(xiàn)出與患者iPSC-CMs相似的心律失常表型（Fig. 1 E and F）?？傊?，這些結(jié)果說明FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X都是缺失突變體其導(dǎo)致FLNC相關(guān)心肌病的單倍機(jī)能不全。

圖2 FLNC^G1891Vfs61X and FLNC^E2189X的功能缺失突變導(dǎo)致FLNC相關(guān)心肌病的單倍機(jī)能不全

3、FLNC缺失導(dǎo)致β-Catenin核定位和β-Catenin信號通路的激活

為了發(fā)現(xiàn)FLNC的分子伴侶，進(jìn)行了共免疫沉淀和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了β-Catenin，經(jīng)免疫印跡證實（Fig. 3A）。在FLNC^KO?/? iPSC-CMs的裂解液中沒有檢測到β-Catenin，而且在FLNC突變的iPSC-CMs的裂解液中β-Catenin的水平也減少了（Fig. 3A）。此外，在FLNC -突變體和FLNC^KO?/? iPSC-CMs的細(xì)胞核中檢測到大量的β-Catenin，而對照iPSC-CMs中β-Catenin主要在細(xì)胞質(zhì)中檢測到（Fig. 3B-C）。此外，FLNC -突變體和FLNC^KO?/? iPSC-CMs的RNA-seq數(shù)據(jù)表達(dá)譜顯示β-Catenin信號通路激活（Fig. 3D）。總之，數(shù)據(jù)表明β-Catenin可能是一種新的FLNC結(jié)合伙伴和FLNC的下游效應(yīng)物，并且iPSC-CMs中FLNC的缺失導(dǎo)致β-Catenin從胞漿遷移到細(xì)胞核，導(dǎo)致β-Catenin信號的激活。

圖3 β-Catenin與FLNC和FLNC激活的β-Catenin信號通路的缺失有關(guān)

4、PDGFRA在FLNC相關(guān)心肌病中上調(diào)并且是β-Catenin的下游調(diào)控因子

為鑒定更多的下游靶點用于藥物開發(fā)，作者比較了FLNC^KO?/?和FLNC^KO+/?的iPSC-CMs的轉(zhuǎn)錄組以鑒定潛在靶基因。如圖Fig. 4A所示，FLNC^KO?/?和FLNC^KO+/?的iPSC-CMs的轉(zhuǎn)錄組有接近相似的上調(diào)和下調(diào)DEGs。對兩者間共有的上調(diào)和下調(diào)DEGs進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與調(diào)控cell-cell adhesion, intercellular communication，ion transport等通路（Fig. 4B to D）。此外，這些上調(diào)的DEGs主要富集至PDGF分子水平的結(jié)合活性（Fig. 4E）。數(shù)據(jù)顯示，與等基因?qū)φ盏?/span>iPSC-CMs相比，FLNC KO系中PDGFRA的表達(dá)水平顯著提高了4倍（Fig. 4F）。由于數(shù)據(jù)表明，FLNC^G1681Vfs61X和FLNC^E2189X突變導(dǎo)致單倍功能不全，作者假設(shè)攜帶這些突變的iPSC-CMs患者的PDGFRA水平也可能升高。如Fig. 4G to H所示，與對照組相比，兩種患者來源的iPSC-CMs中PDGFRA均上調(diào)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)提示PDGFRA信號通路的激活與FLNC相關(guān)心肌病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

圖4細(xì)胞粘附途徑的失調(diào)導(dǎo)致PDGFRA在FLNC相關(guān)心肌病發(fā)病機(jī)制中的激活

β-Catenin被認(rèn)為可以上調(diào)PDGFRA在其他組織和/或疾病中的表達(dá)。由于觀察到β-Catenin在FLNC缺失的iPSC-CMs中有顯著的核定位，于是研究了β-Catenin是PDGFRA上游轉(zhuǎn)錄激活因子的假設(shè)。因此，使用β-Catenin抑制劑(JW67和JW74)在不同濃度下抑制β-Catenin，并觀察到PDGFRA轉(zhuǎn)錄水平的劑量依賴性抑制（Fig. 5A）。此外，ChIP下拉實驗表明，已知的轉(zhuǎn)錄因子和β-Catenin結(jié)合伙伴SOX2與PDGFRA啟動子區(qū)結(jié)合（Fig. 5B）?？傊?，數(shù)據(jù)表明β-Catenin是PDGFRA的轉(zhuǎn)錄激活因子，并且β-Catenin的核定位導(dǎo)致PDGFRA在FLNC缺失的iPSC-CMs中持續(xù)上調(diào)。

圖5 β-Catenin可能是PDGFRA的轉(zhuǎn)錄激活因子

5、PDGFRA抑制挽救了connexin 43的膜定位

研究顯示PDGFRA通過激活MAPK/ERK信號通路，破壞細(xì)胞膜上connexin43（縫隙連接蛋白-1 (GJA1)）的信號。作者發(fā)現(xiàn)，與對照iPSC-CMs相比，FLNC突變體和KO iPSC-CMs的ERK激活并且GJA1離開細(xì)胞膜（Fig. 6A）。為了測試FLNC單倍不足的iPSC-CMs中PDGFRA的激活是GJA1定位錯誤的原因，使用FDA批準(zhǔn)的藥物crenolanib對PDGFRA進(jìn)行藥物抑制，以確定對GJA1膜定位的影響。免疫熒光研究表明，crenolanib抑制PDGFRA可以挽救GJA1在膜上的定位（Fig. 6A）。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與FLNCG1891Vfs61X和KO iPSC-CMs相比，F(xiàn)LNCE2189X突變體iPSC-CMs對crenolanib的反應(yīng)最大，拯救的DEGs數(shù)量最多（Fig. 6B）。GSEA揭示了細(xì)胞粘附途徑(hsa04510)的部分正?；?，支持了cell-cell adhesion位點的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定促進(jìn)了GJA1粘附在細(xì)胞膜上的假設(shè)（Fig. 6C）。然而，通過免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)crenolanib處理后GJA1的表達(dá)水平?jīng)]有改變，這表明PDGFRA抑制并不影響GJA1的表達(dá)水平，而是影響GJA1的轉(zhuǎn)運（Fig. 6D）。最后，也是最重要的一點是，crenolanib處理也顯著改善了來自FLNC患者的iPSC-CMs的收縮性，并減少了心律失常，但對健康對照組而言并非如此（Fig. 6E-F）。綜上，說明FLNC缺失導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞黏附系統(tǒng)失調(diào)，抑制PDGFR信號通路改善FLNC突變體iPSC-CMs的收縮性.

圖6 FLNC缺失導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞黏附系統(tǒng)失調(diào)，抑制PDGFR信號通路改善FLNC突變體iPSC-CMs的收縮性

6、PDGFRA抑制減弱了β-catenin核定位

通過免疫熒光檢測到，與對照組iPSC-CMs相比，FLNC突變體iPSC-CMs中β-catenin的核定位增加，但在crenolanib處理后，β-catenin的核定位減少（Fig. 7A）。qPCR證實crenolanib處理對β-catenin核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，β-catenin靶基因TCF4、SOX9、COL1A2、TGF 3的轉(zhuǎn)錄水平降低（Fig. 7B）。此外，通過GSEA分析比較crenolanib治療前后患者源性和KO iPSC-CMs的DEGs譜，進(jìn)一步證實PDGFRA信號抑制后β-catenin信號通路部分恢復(fù)（Fig. 7C-D）。因此，證據(jù)表明PDGFRA的激活增強(qiáng)了β-catenin信號，并促進(jìn)了一個正反饋回路。此外，PDGFR抑制可以部分恢復(fù)β-catenin膜定位，減少FLNCtv突變引起的β-catenin的激活。

圖7 PDGFRA抑制減緩了β-catenin信號通路及其在FLNC突變體iPSC-CMs中的核定位

7、a-DCM中PDGFRA信號的激活

為了證實體外研究的結(jié)果，測定了a-DCM患者心臟中PDGFRA的表達(dá)水平。在a-DCM患者中(n = 5)， 1例患者是FLNC^G1891V61X突變的姐妹。另外4例患者診斷為特發(fā)性DCM合并室性心律失常。發(fā)現(xiàn)a-DCM患者心臟PDGFRA水平升高， PDGFRA下游效應(yīng)物ERK被激活（Fig. 8A and B）。此外，還確定了β-catenin和GJA1在DCM心臟中的表達(dá)水平和定位。雖然β-catenin和GJA1的表達(dá)水平結(jié)果保持不變，但免疫熒光染色檢測到β-catenin和GJA1從細(xì)胞膜上分離（Fig. 8C and E）。此外，移植心臟的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，與DCM (n = 15)和未衰竭心臟(n = 12)相比，a-DCM (n = 20)心臟中PDGFRA mRNA的豐度顯著更高（Fig. 8F）。RNA-seq數(shù)據(jù)經(jīng)qPCR驗證，如Fig. 8G所示。此外，各組間PDGFRB mRNA轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生變化，提示FLNC突變引起a-DCM的致病機(jī)制是特異性于PDGFRA亞型的（Fig. 8F）?？傊C實了來自患者特異性和KO iPSC-CM系和人類a-DCM移植心臟的體外發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)烈表明PDGFRA促進(jìn)a-DCM的致病信號傳導(dǎo)。

圖8 PDGFRA的上調(diào)有助于GJA1和β-catenin在心律失常性擴(kuò)張型心肌病心臟的離域

總之，如圖9，本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin是FLNC的下游靶點，FLNC單倍不足不僅影響cell-cell adhesion、細(xì)胞骨架和肌肉組織，還增加β-catenin的核遷移，進(jìn)而上調(diào)PDGFRA的轉(zhuǎn)錄。隨后PDGFRA信號的激活可能是FLNC突變體iPSC-CMs中觀察到的收縮功能障礙和電不穩(wěn)定的原因。FLNC 單倍不足和隨后PDGFRA激活引起的心律不齊的表現(xiàn)型至少部分是由于GJA1位移引起的細(xì)胞膜的幾種機(jī)制導(dǎo)致的，如PDGFRA下游靶點ERK磷酸化，ID中斷和異常易位。

圖9 FLNC相關(guān)心肌病的疾病模型

參考文獻(xiàn)：

Chen Suet Nee., Lam Chi Keung., Wan Ying-Wooi., Gao Shanshan., Malak Olfat A., Zhao Shane Rui., Lombardi Raffaella., Ambardekar Amrut V., Bristow Michael R., Cleveland Joseph., Gigli Marta., Sinagra Gianfranco., Graw Sharon., Taylor Matthew R G., Wu Joseph C., Mestroni Luisa.(2022). Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Adv, 8(8), eabk0052. doi:10.1126/sciadv.abk0052