去泛素酶USP27通過穩(wěn)定SETD3促進(jìn)細(xì)胞增殖和肝細(xì)胞癌進(jìn)展
組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD3在各種生物事件中發(fā)揮著重要作用，其失調(diào)常與包括癌癥在內(nèi)的人類疾病有關(guān)。然而，潛在的監(jiān)管機(jī)制仍然難以捉摸。近日，有文獻(xiàn)報(bào)道了泛素特異性肽酶27 （USP27）通過與SETD3特異性相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)其泛素化作用，并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。該研究于2022年1月發(fā)表在《Cellular and Molecular Life Sciences》，IF：9.621。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
為了確定SETD3在肝臟腫瘤發(fā)生過程中異常表達(dá)的分子機(jī)制，利用DUB文庫篩選SETD3相互作用的蛋白，該蛋白可能與SETD3的異常調(diào)控有關(guān)。通過免疫沉淀和western blot檢測所示，SETD3被USP27拉下，SETD3也可以拉下USP27，說明USP27是真正的SETD3交互伙伴（圖1A和B）。內(nèi)源性SETD3是否與Hep3B細(xì)胞中的USP27相互作用：在anti-USP27中檢測到SETD3，但在正常兔IgG免疫沉淀中未檢測到（圖1C）。此外，體外GST pull-down、PLA兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了USP27與SETD3相互作用（圖1D-F）。最后，通過突變體確定了USP27與SETD3之間的相互作用區(qū)域：USP27的C端UCH域（圖1G-I）。此外，突變分析表明，SETD3與USP27的相互作用需要RSB域（圖1J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明USP27與SETD3相互作用。
圖1 USP27與SETD3相互作用
由于USP27是一種DUB（去泛素化化酶），可能會(huì)保護(hù)其底物免受蛋白酶體介導(dǎo)的降解，接下來確定該DUB是否會(huì)從SETD3中去除泛素。如圖2A所示，在存在USP27表達(dá)的情況下，與SETD3連接的多聚素鏈被完全去除。與野生型（WT） USP27相比，USP27的酶活性突變體（C87A）未能消除SETD3蛋白的泛素化（圖2B和C），這意味著USP27需要DUB活性才能從SETD3中去除泛素。USP27介導(dǎo)的SETD3去泛素化是非常特異性的，因?yàn)?/span>USP39并沒有顯著影響SETD3去泛素化（圖2D）。此外，與shRNA對照相比，USP27表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致SETD3泛素化升高（圖2E）。因此，為了確定SETD3上的多聚泛素鏈的哪一種泛素連鎖是受USP27調(diào)控的，使用泛素突變體，其中只有位于11 （K11O）、48 （K48O）或63（K63O）位點(diǎn)的一個(gè)賴氨酸殘基可被泛素化。如圖2F所示，USP27過表達(dá)降低了SETD3的K48-連鎖泛素化，但對SETD3的K11-或K63 -連鎖泛素化無影響?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明USP27是SETD3的一個(gè)真正的DUB，并以DUB活性依賴的方式去除SETD3的K48連鎖多泛素化。
圖2 USP27抑制SETD3的K48連鎖多泛素化
3. SETD3蛋白的穩(wěn)定性受USP27調(diào)控
之前研究發(fā)現(xiàn)USP27能夠促進(jìn)SETD3在K48位點(diǎn)的去泛素化。為了研究這種翻譯后修飾是否促進(jìn)了SETD3的穩(wěn)定性，將SETD3表達(dá)構(gòu)建物與空載體（EV）或USP27質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，檢測SETD3在不同時(shí)間環(huán)己亞胺（CHX）作用下的蛋白水平。如圖3A、B所示，USP27共轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)SETD3蛋白表達(dá)，USP27顯著延長SETD3蛋白的半衰期。此外，USP27的異位表達(dá)上調(diào)了內(nèi)源性SETD3蛋白水平（圖3C和D）。USP27/CA突變體的催化活性不能保護(hù)SETD3免受降解（圖3E和F）。為了進(jìn)一步證實(shí)USP27調(diào)節(jié)SETD3穩(wěn)定性的觀點(diǎn)，在Hep3B細(xì)胞中敲除了USP27的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性SETD3蛋白水平比對照組下降得更快（圖3G和H）。此外，蛋白酶體特異性抑制劑MG132可以保護(hù)SETD3免受降解（圖3I， J）。說明SETD3蛋白降解是通過蛋白酶體途徑進(jìn)行的。最后，在USP27過表達(dá)的Hep3B細(xì)胞中，SETD3 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化（圖3K），提示USP27可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控SETD3蛋白降解。綜上所述，以上數(shù)據(jù)表明USP27可以正向調(diào)控SETD3蛋白的穩(wěn)定性。
圖3 USP27促進(jìn)SETD3穩(wěn)定
4. SETD3逆轉(zhuǎn)USP27基因敲除介導(dǎo)的細(xì)胞增殖阻滯
由于USP27具有去泛素化和穩(wěn)定SETD3的作用，可能通過調(diào)節(jié)SETD3蛋白水平來促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，首先評估了生物USP27在肝癌中的作用 （圖4）。如圖4 A和B所示， 敲除USP27明顯減少Hep3B和MHCC97H細(xì)胞的細(xì)胞生存能力。將SETD3引入USP27基因敲除細(xì)胞，可部分恢復(fù)其惡性表型，而這兩種蛋白的敲除均可顯著抑制細(xì)胞能力。集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，USP27在Hep3B或MHCC97H細(xì)胞中的穩(wěn)定敲除顯著抑制了集落形成（圖4C-F）。此外，5-EdU顯示，USP27或SETD3的敲除與EdU標(biāo)記細(xì)胞的顯著下降百分率相關(guān)。在USP27或SETD3敲除細(xì)胞中加入SETD3的表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)（圖4G和H）。同樣，Ki67免疫熒光染色也證實(shí)了增殖下降，因?yàn)樵?/span>USP27或SETD3敲除細(xì)胞中Ki67陽性增殖細(xì)胞的比例顯著降低。Ki67陽性細(xì)胞的增加也提示更多的G0靜止細(xì)胞在SETD3過表達(dá)后重新進(jìn)入細(xì)胞周期，因?yàn)?/span>Ki67只在細(xì)胞周期的活動(dòng)期而不是G0靜止期表達(dá)。這些結(jié)果也表明，隨著USP27或SETD3基因的下調(diào)，G0/G1期細(xì)胞部分的總大小增加，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明USP27和SETD3對細(xì)胞增殖至關(guān)重要。
圖4抑制USP27表達(dá)可阻斷細(xì)胞增殖，延緩細(xì)胞生長
5. 在體內(nèi)下調(diào)USP27可抑制HCC細(xì)胞生長
為了評價(jià)USP27和SETD3在體內(nèi)對細(xì)胞生長的影響，將Hep3B細(xì)胞系皮下注射到裸鼠右側(cè)側(cè)腹建立異種移植模型。在腫瘤發(fā)展過程中，從注射后第6天開始每3天測量一次腫瘤體積，結(jié)果顯示USP27和SETD3敲除細(xì)胞的腫瘤生長均顯著下降（圖5A）。注射后27天，解剖腫瘤，拍照（圖5B）并稱重（圖5C）。USP27或SETD3敲除細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤明顯比對照細(xì)胞更小、更輕，而在USP27缺失細(xì)胞中過表達(dá)SETD3可恢復(fù)腫瘤生長。此外，通過Ki67染色檢測，USP27基因敲除細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞活力也有所下降（圖5D）。這些結(jié)果表明，USP27的缺失也抑制了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)生長。
圖5體內(nèi)下調(diào)USP27基因可抑制HCC細(xì)胞的生長
6. 抑制USP27的表達(dá)會(huì)損害SETD3的促遷移能力
由于SETD3的上調(diào)可促進(jìn)肝臟腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展，因此USP27也可能通過穩(wěn)定SETD3來增強(qiáng)轉(zhuǎn)移表型。為了探究USP27-SETD3軸在細(xì)胞遷移和侵襲中的作用，進(jìn)行了創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與對照細(xì)胞相比，SETD3或USP27基因的下調(diào)顯著抑制了細(xì)胞遷移。而將SETD3引入USP27基因敲低的細(xì)胞則部分恢復(fù)了轉(zhuǎn)移表型（圖6A-D）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)一致顯示，USP27和SETD3在Hep3B細(xì)胞（圖6E， F）和MHCC97H細(xì)胞（圖5G， H）的腫瘤侵襲中的作用類似。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，USP27或SETD3的下調(diào)可以阻止肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
圖6 抑制USP27表達(dá)可損害肝細(xì)胞癌細(xì)胞中SETD3的促遷移能力
7. USP27和SETD3在肝癌樣本中表達(dá)上調(diào)
USP27-SETD3軸能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，推測它們可能在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。首先，使用western blot檢測了USP27和SETD3在HCC組織（n = 10）和匹配的相鄰正常肝組織（n = 10）中的表達(dá)水平（圖7A）。如圖7B所示：USP27與SETD3蛋白水平明顯上調(diào)且呈正相關(guān)。通過對肝癌組織和正常組織的免疫組化染色進(jìn)一步檢測兩者之間的關(guān)系：與匹配的正常肝組織相比，SETD3和USP27在HCC組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖7C）。根據(jù)患者的mRNA表達(dá)水平分為高表達(dá)組（高于正常組織平均水平）和低表達(dá)組（低于或等于正常組織平均水平），比較兩組患者的生存期：與低表達(dá)的患者相比，USP27高表達(dá)患者的5年生存率明顯降低（圖7D）。SETD3的分析也得到了類似的結(jié)果?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，作者得出結(jié)論，SETD3被USP27去泛素化，其蛋白水平受到USP27表達(dá)的正調(diào)控，并與USP27表達(dá)相關(guān)。肝細(xì)胞癌患者USP27的上調(diào)導(dǎo)致SETD3表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和腫瘤發(fā)生。
圖7肝細(xì)胞癌組織中USP27和SETD3表達(dá)上調(diào)
主要結(jié)論：
在這里，該研究闡明了通過USP27的翻譯后修飾對SETD3的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)（圖8）。首先發(fā)現(xiàn)USP27是Hep3B細(xì)胞中SETD3的相互作用伙伴。USP27能夠去泛素化并穩(wěn)定SETD3。此外，體內(nèi)外研究表明，USP27的缺失抑制了HCC細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生，而SETD3的過表達(dá)挽救了這種表型。SETD3和USP27水平在HCC中明顯高于相關(guān)相鄰組織。利用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)USP27和SETD3的表達(dá)水平與HCC患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān)。總之，這項(xiàng)研究中的發(fā)現(xiàn)可以更好地理解USP27-SETD3軸在癌癥發(fā)展中的作用和分子機(jī)制，為癌癥治療提供新的策略。
圖8 USP27調(diào)節(jié)SETD3的模型示意圖
參考文獻(xiàn)：
Zou T, Wang Y, Dong L, Che T, Zhao H, Yan X, Lin Z. Stabilization of SETD3 by deubiquitinase USP27 enhances cell proliferation and hepatocellular carcinoma progression. Cell Mol Life Sci. 2022;79(1):70.