尼魯單抗可提高PD-1+處理的人結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率,并可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受傳統(tǒng)療法的傷害

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-03-29
PD-1信號(hào)通路激活致癌功能,而在肺癌細(xì)胞中,它具有腫瘤抑制作用。本研究工作旨在評(píng)估抗PD -1 尼魯單抗 (NIVO)藥物治療CRC的效果......


結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)、最致命的腫瘤之一。大多數(shù)的CRC對(duì)以抗程序性細(xì)胞死亡蛋白-1 (PD-1)為基礎(chǔ)的癌癥免疫治療耐藥。約15%具有高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、高腫瘤突變負(fù)擔(dān)和腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。PD-1信號(hào)通路激活致癌功能,而在肺癌細(xì)胞中,它具有腫瘤抑制作用。本研究工作旨在評(píng)估抗PD -1 尼魯單抗 (NIVO)藥物治療CRC的效果。本研究于20223月發(fā)表于《Journal for Immuno Therapy of cancer》,IF=13.751。

 

本文技術(shù)路線:


本文主要內(nèi)容:

1. PD-1阻斷增加結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)

首先,在人結(jié)腸癌細(xì)胞中評(píng)估PD-1PD-L1水平。在HT29、HCT116、LoVo、SW620Colo205細(xì)胞中檢測(cè)到PD-1,但未檢測(cè)到PD-L1 (Fig 1A)。與SW620Colo205細(xì)胞相比,HT29、HCT116LoVo細(xì)胞明顯過(guò)表達(dá)PD-1。已有研究表明,當(dāng)IFN誘導(dǎo)PD-L1時(shí),I(IFN-α)II(IFN-γ)干擾素帶來(lái)的影響取決于PD-1PD-L1的表達(dá)。在HT29HCT116細(xì)胞蛋白水平和轉(zhuǎn)錄組水平上,IFN-αIFN-γ均不能誘導(dǎo)PD-1,而IFN-αIFN-γ均能誘導(dǎo)PD-L1 (Fig 1B)。為評(píng)估細(xì)胞PD-1信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29、HCT116LoVo用可溶性PD-L1 NIVO進(jìn)行處理。Fig 1C所示,sPD-L1增加了HT29、HCT116LoVo細(xì)胞凋亡。如Fig 1D所示,NIVO促進(jìn)了細(xì)胞增長(zhǎng),而sPD-L1抑制了其生長(zhǎng)。 HT29HCT116細(xì)胞中,六個(gè)小時(shí)NIVO(10 μM)處理誘導(dǎo)pERK表達(dá),但是NIVO (10 μM)降低了人黑色素瘤細(xì)胞PES43pERK (Fig 1E)

此外,6小時(shí)NIVO(10 μM)增加了HT29pP38的含量,但NIVO對(duì)K-RAS突變細(xì)胞HCT116中的pP38無(wú)影響(Fig 2C)。相反, 6小時(shí)NIVO(10 μM)處理減少了PES43pP38水平,這些數(shù)據(jù)表明PD-1通過(guò)抑制P38ERK信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步研究下游信號(hào)通路在PD-1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中的作用,作者在MEK/ ERK1/2/AKT/P38抑制劑存在下評(píng)價(jià)HT29HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),激酶抑制劑顯著恢復(fù)了NIVO誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)。在HCT116中,AKTMEK/ERK1/2抑制劑都能恢復(fù)NIVO誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng),而正如預(yù)期的那樣,P38抑制劑不影響細(xì)胞增殖。

Fig 1 PD-1阻斷增加結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)

 
2.NIVO保護(hù)結(jié)腸癌細(xì)胞免受化療/放療傷害,并增強(qiáng)球狀生長(zhǎng)

為了研究PD-1信號(hào)通路對(duì)化療的影響,作者在 NIVO存在的情況下,用5-FUOXA、CDDP、DOXO、IRITAX治療人結(jié)腸癌細(xì)胞72小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NIVO 降低了化療療效,增加了HT29HCT116LoVo5-FU、OXAIRI水平。此外,在HT29、HCT116LoVo細(xì)胞中,5-FUOXA加入NIVO后,細(xì)胞凋亡率降低(Fig 2A)。

NIVO存在的HCT116HT29細(xì)胞暴露于2-4-8 Gyx射線中(Fig 2B i)。在HT29HCT116細(xì)胞中,NIVO增強(qiáng)了對(duì)輻射的抵抗力,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)(Fig 2B i)。NIVO- f (ab)2 (1μM)處理與NIVO處理效果相同(Fig 2B ii)。

此外,為了重現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的三維相互作用和相對(duì)藥物敏感性,將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、HCT116SW620在球體和NIVO/中進(jìn)行三維培養(yǎng)評(píng)價(jià)NIVO + OXA療效。從圖2C中可以看出,在HT29種用NIVO處理(10 μM)增強(qiáng)了HT29的球體平均面積,而在HT29、HCT116、HT29OXA、SW620中處理顯著減少了的球體平均面積??傊?/span>NIVO抑制了OXA對(duì)HT29HCT116球形細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,但對(duì)低表達(dá)PD-1SW620細(xì)胞無(wú)影響。

Fig2 NIVO保護(hù)結(jié)腸癌細(xì)胞免受化療/放療傷害,并增強(qiáng)球狀生長(zhǎng)

 

3. NIVO誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞差異基因表達(dá)

對(duì)HT29 HCT116細(xì)胞用NIVO、sPD-L1、sPD-L1+NIVO進(jìn)行6-24小時(shí)NIVO處理,并與PES43細(xì)胞比較,進(jìn)行RNA測(cè)序。確定結(jié)腸癌細(xì)胞中治療影響的基因。如圖3A中的主成分分析(PCA)所示,HCT116HT29PES43獨(dú)立的聚為3類(lèi)。6個(gè)小時(shí)的處理后,在PES43,HT29HCT116中發(fā)現(xiàn)8306,6183846個(gè)差異表達(dá)基因。24個(gè)小時(shí)的處理后,在PES43,HT29HCT116中發(fā)現(xiàn)731211475410個(gè)差異表達(dá)基因。

作者重點(diǎn)研究了HT29HCT116PES43中共同調(diào)控的基因,分別在NIVO治療6小時(shí)和24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)了149個(gè)和299個(gè)共同基因(Fig 3C)。在NIVO治療6小時(shí)和24小時(shí)時(shí)分別篩選19個(gè)(NIVO-6小時(shí))67個(gè)(NIVO-24小時(shí))PES43相關(guān)(Fig 3D)

在處理6小時(shí)時(shí),BATF2, IFIT3TNFRSF11APES43中表達(dá)上調(diào)(Fig 4)。因此,6小時(shí)的NIVO治療可能會(huì)影響HT29HCT116的基因表達(dá),使HT29HCT116具有更強(qiáng)的侵襲性表型,而PES43具有較弱的侵襲性表型,腫瘤抑制因子的減少和先天免疫反應(yīng)、1-IFN信號(hào)通路和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路的調(diào)控基因相關(guān),這些特征在治療24小時(shí)內(nèi)保持不變(Fig 4)。在處理6個(gè)小時(shí)和24個(gè)小時(shí)的HT29HCT116細(xì)胞中中分別篩選12個(gè)基因進(jìn)行 qRT-PCR驗(yàn)證,得到相同的結(jié)果。

Fig3 NIVO處理的人類(lèi)結(jié)腸癌和黑色素瘤細(xì)胞中的差異表達(dá)基因(DEGs)

Fig4 Nivo處理的人類(lèi)結(jié)腸癌和黑色素瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因(DEGs)Go富集分析


4. NIVO
增強(qiáng)HT29腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)

HT29異種移植模型評(píng)價(jià)NIVO效應(yīng)。將HT29細(xì)胞接種于CD1胸腺病小鼠,當(dāng)腫瘤達(dá)到50 mm3時(shí),將小鼠隨機(jī)分為四組,每周兩次腹腔注射PBS (n=6)NIVO (n=6)、OXA (n=6)以及NIVO +OXA聯(lián)合(n=6)治療3周。用HE評(píng)估腫瘤組織學(xué)。與體外實(shí)驗(yàn)一致,NIVO顯著增加腫瘤生長(zhǎng)1.88(Fig 5A),提示PD-1阻斷可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),降低化療療效。同樣,與對(duì)照組相比,NIVO組腫瘤體積增大(Fig 5B)。與未處理組和與OXA聯(lián)合組相比,NIVO顯著增加了Ki-67表達(dá)細(xì)胞的比例(p=0.023) (p=0.027) (Fig 5C)。此外,NIVOcleaved caspase-3檢測(cè)結(jié)果顯示,NIVO + OXA顯著降低了凋亡細(xì)胞的比例。此外,nivo處理的腫瘤與未處理的腫瘤相比,P38表達(dá)水平更高。有趣的是,在OXA處理的腫瘤中,pP38陽(yáng)性細(xì)胞顯著降低(p=0.0061),而在NIVO + OXA處理的腫瘤中,pP38陽(yáng)性細(xì)胞增加(p=0.0047),表明NIVO處理的腫瘤中細(xì)胞增殖更高。此外,與OXA治療組相比,OXA + NIVOpERK1/2顯著升高。

癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,PD-1編碼的PDCD1基因在包括CRC在內(nèi)的17種癌癥中被廣泛轉(zhuǎn)錄。然而,結(jié)腸癌組織中有浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞。通過(guò)免疫組化分析48份石蠟包埋的結(jié)腸癌樣本中PD-1的表達(dá)情況。PD-1TME和癌細(xì)胞中表達(dá)。臨床病理特征顯示原發(fā)性腫瘤的大小與PD-1的表達(dá)顯著相關(guān),而且PD-1主要在結(jié)腸癌黏液組織中表達(dá)。

Fig5 PD-1阻斷加速皮下HT29腫瘤生長(zhǎng),降低化療療效

 

本提供了第一個(gè)PD-1靶向?qū)е陆Y(jié)腸癌放射/化療耐藥的報(bào)告。腫瘤細(xì)胞固有的PD-1/PD-1表達(dá)可能代表CRC患者免疫檢查點(diǎn)阻斷選擇的潛在生物標(biāo)志物。PD-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

 

參考文獻(xiàn)

Ierano, C., et al., In PD-1+ human colon cancer cells NIVOLUMAB promotes survival and could protect tumor cells from conventional therapies. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).