腫瘤芽來源的CCL5招募成纖維細(xì)胞，通過CCR5-SLC25A24信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展

腫瘤出芽在結(jié)直腸癌（CRC）的常規(guī)診斷中，被認(rèn)為是獨立于TNM分期的腫瘤預(yù)后因素。近日，有研究發(fā)現(xiàn)：在結(jié)直腸癌（CRC）的侵襲前沿，腫瘤芽源性趨化因子配體5（CCL5）可以通過CCR5 SLC25A24信號招募成纖維細(xì)胞，通過招募的成纖維細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)血管生成和膠原合成，最終形成促腫瘤微環(huán)境（TME）。因此，CCL5可能成為CRC腫瘤出芽的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CRC腫瘤細(xì)胞可將成纖維細(xì)胞招募到腫瘤芽中

作者使用H&E染色對195個臨床CRC組織樣本進(jìn)行評估，結(jié)果顯示，CRC癌組織浸潤前沿的腫瘤出芽比未出芽的其他腫瘤部位有更多的成纖維細(xì)胞（圖1a）。腫瘤芽周圍的成纖維細(xì)胞顯示出α-SMA和CD90的高表達(dá)，但FAP的低表達(dá)（α-SMA^high CD90 ^high FAP^low）（圖1b）。這些結(jié)果表明，CRC組織浸潤前沿的腫瘤出芽與成纖維細(xì)胞異質(zhì)性密切相關(guān)。作者又通過檢測上皮標(biāo)記物E-cadherin、成纖維細(xì)胞標(biāo)記物vimentin和α-SMA來鑒定成纖維細(xì)胞（圖1c）。

通過共培養(yǎng)招募試驗，發(fā)現(xiàn)FHC（人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系）和LS174T、RKO、DLD-1、Caco2（人CRC細(xì)胞系）具有較弱的招募成纖維細(xì)胞的能力。相比之下，HCT-8、HCT116、HCT-15和SW620（人CRC細(xì)胞株）表現(xiàn)出更強的招募能力（圖1d和e）。由于HCT116細(xì)胞在體外表現(xiàn)出強大的招募成纖維細(xì)胞的能力，被用于進(jìn)一步的活體原位CRC異種移植小鼠實驗。使用H&E染色檢查小鼠盲腸中的腫瘤，觀察到HCT116也可以在體內(nèi)招募成纖維細(xì)胞（圖1f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CRC的腫瘤芽可以招募成纖維細(xì)胞。

圖1結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞可將成纖維細(xì)胞招募到腫瘤芽中

2. 腫瘤芽中的CRC腫瘤細(xì)胞通過CCL5招募成纖維細(xì)胞

為了進(jìn)一步確定結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞募集的原因，使用人類細(xì)胞因子陣列進(jìn)行分析（圖2a）。GO功能富集分析表明，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與各種活動（圖2b）。這表明，CRC腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以招募TME中的其他細(xì)胞，并可能參與招募成纖維細(xì)胞，而成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。

在差異表達(dá)的蛋白中，CCL5在人類CRC腫瘤細(xì)胞的CM樣本中表達(dá)最多（圖2c）。在FHC和8個人CRC腫瘤細(xì)胞株中檢測CCL5的mRNA和分泌蛋白水平，結(jié)果與共培養(yǎng)招募試驗的初步結(jié)果完全一致（圖2d, e）。此外，CCD-18Co和人類原代正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞分泌的CCL5水平低于FHC（圖2f）。因此，CCL5介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的招募似乎是通過旁分泌而不是自分泌信號發(fā)生的。接下來，用免疫組化法檢測人CRC組織中CCL5的表達(dá)，結(jié)果顯示CCL5在侵襲前部的腫瘤芽中高表達(dá)（圖2g）。為了檢驗CCL5是否為成纖維細(xì)胞招募的關(guān)鍵細(xì)胞因子，再次進(jìn)行招募實驗（圖2h）。CCL5可以招募到CCD-18Co和不同的人類原代正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞（圖2i）。最后，為了確定招募成纖維細(xì)胞的CCL5是否由CRC腫瘤細(xì)胞分泌，分別用siRNA和慢病毒構(gòu)建了CCL5敲除和過表達(dá)的細(xì)胞系。共培養(yǎng)招募實驗（圖2j）顯示，敲除CCL5后，腫瘤細(xì)胞招募成纖維細(xì)胞的能力明顯減弱（圖2k）。相比之下，當(dāng)CCL5過表達(dá)時，這種能力增強（圖2l）。招募分析，CM樣本穩(wěn)定細(xì)胞（圖2m）顯示效果類似于觀察整個細(xì)胞（圖2 n, o）。這些結(jié)果表明CCL5在CRC腫瘤芽中高度表達(dá)，并能從TME招募成纖維細(xì)胞。

圖2腫瘤芽中的CRC腫瘤細(xì)胞通過CCL5募集成纖維細(xì)胞

3. CCL5通過CCR5受體招募成纖維細(xì)胞

為了探究CCL5是否通過它的受體介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的招募，使用siRNA分別下調(diào)它們在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，并驗證了干擾效率（圖3a, b）。接下來，進(jìn)行招募檢測，如圖3c所示：只有在成纖維細(xì)胞中下調(diào)CCR5才能顯著減弱CCL5招募成纖維細(xì)胞的能力（圖3d）。

此外，在共培養(yǎng)招募試驗之前和期間，分別使用CCR1抑制劑BX471和CCR5抑制劑Maraviroc治療成纖維細(xì)胞，并阻斷CCR1和CCR5（圖3e）。只有Maraviroc治療顯著削弱了CCL5招募成纖維細(xì)胞的能力（圖3f）。以上結(jié)果強烈表明CCL5通過CCR5受體參與成纖維細(xì)胞招募。

圖3 CCL5通過CCR5受體招募成纖維細(xì)胞

4. 在成纖維細(xì)胞中，SLC25A24介導(dǎo)CCL5依賴的成纖維細(xì)胞補充

為了探究CCL5刺激后成纖維細(xì)胞的胞內(nèi)變化，使用CCL5治療前后的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序（圖4a）。選取差異表達(dá)前20個基因進(jìn)行驗證：在CCL5治療后，SLC25A24 mRNA水平在人類原代正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞中上調(diào)（圖4b）。

采用IF法檢測SLC25A24蛋白在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)和定位。結(jié)果顯示，SLC25A24在侵襲前部腫瘤芽周圍的成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)（圖4c）。在體內(nèi)，在sh-CCL5轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞的腫瘤異種移植中，觀察到成纖維細(xì)胞中SLC25A24的表達(dá)減少（圖4d）。

功能上，為了探索CCL5介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞招募是否依賴于SLC25A24，將抗SLC25A24的siRNA轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行招募實驗（圖4e）。成纖維細(xì)胞中SLC25A24表達(dá)的減少顯著削弱了CCL5招募成纖維細(xì)胞的能力（圖4f, g）。這表明CCL5介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞招募依賴于SLC25A24和CCR5。

KEGG富集分析表示PI3K-Akt信號通路在CCL5刺激后最為活躍（圖4h）。免疫印跡結(jié)果顯示，CCL5可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞Akt和mTOR的磷酸化（圖4i，左圖）。相比之下，當(dāng)SLC25A24的表達(dá)被抑制時，CCL5刺激后成纖維細(xì)胞磷酸化的Akt和mTOR水平下降（圖4i，右圖）。這些發(fā)現(xiàn)表明CCL5通過成纖維細(xì)胞中的SLC25A24- pAkt-pmTOR軸招募成纖維細(xì)胞。

圖4成纖維細(xì)胞中SLC25A24介導(dǎo)CCL5依賴性成纖維細(xì)胞補充

5. CCL5有助于增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤血管生成

最初發(fā)現(xiàn)（圖1b）證明腫瘤芽周圍的成纖維細(xì)胞是α-SMA^high, CD90^high和FAP^low。為了檢驗CCL5是否是增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞的主要原因，進(jìn)行了IF試驗。該實驗表明，經(jīng)CCL5處理的成纖維細(xì)胞中α-SMA和CD90的表達(dá)升高（圖5a）。下一步研究CCL5在成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成中的作用。免疫印跡顯示CCL5處理后成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮標(biāo)志物FLI1、VE-cadherin、CD31、VEGFA水平以及α-SMA和CD90水平升高（圖5b）。流式細(xì)胞術(shù)也顯示，在CCL5刺激后，VE-cadherin⁺成纖維細(xì)胞亞群的比例增加（圖5c）。CCL5刺激后增強成纖維細(xì)胞的促血管生成能力（圖5d）。在侵襲性前沿，CCL5在腫瘤芽中高表達(dá)，腫瘤芽被大量的α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞和血管包圍（圖5e）。綜上，腫瘤芽源CCL5增加了α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞的數(shù)量，并通過增加VEGFA和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤血管生成。

圖5 CCL5有助于增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤血管生成

6. CCL5通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

GO功能富集分析表明，CCL5也參與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)功能（圖6a）。WB分析顯示CCL5可以增加體外成纖維細(xì)胞中COL1和COL3的蛋白表達(dá)（圖6b）。臨床樣本中，CRC組織中CCL5的表達(dá)明顯高于正常組織（圖6c）。采用Pearson’s^χ2檢驗分析CCL5表達(dá)與臨床特征之間的相關(guān)性（表1）。進(jìn)一步的Spearman相關(guān)性試驗表明，CCL5高水平表達(dá)與腫瘤芽增加的高風(fēng)險（圖6 d）呈正相關(guān)。此外，對195例人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的88例進(jìn)行了COL1和COL3染色，以檢測膠原分布。結(jié)果顯示結(jié)腸結(jié)直腸癌組織中COL1和COL3表達(dá)升高（圖6e）。采用Pearson’s^χ2檢驗分析Sirius Red染色與CRC臨床特征的相關(guān)性（表2）。進(jìn)一步的Spearman相關(guān)性檢驗顯示，CRC腫瘤細(xì)胞周圍膠原蛋白的高分布與腫瘤芽的增加呈正相關(guān)（圖6f）。CCL5在侵襲性前緣腫瘤芽中的高表達(dá)往往伴隨著膠原合成的增加（圖6g）。Spearman相關(guān)性分析顯示，同一CRC組織樣本中，腫瘤細(xì)胞中CCL5的表達(dá)水平與周圍膠原蛋白的數(shù)量呈正相關(guān)（圖6h）。

隨后，利用分泌大量CCL5的HCT116細(xì)胞建立原位CRC異種移植小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)分析。發(fā)現(xiàn)侵襲性前沿的腫瘤細(xì)胞周圍膠原合成增加（圖6i）。利用人CRC基因芯片圖譜GSE39582分析COL1或COL3低表達(dá)和高表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存期：COL1和COL3的高表達(dá)與CRC患者預(yù)后不良密切相關(guān)（圖6j）。綜上所述，腫瘤芽分泌CCL5，然后通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

圖6 CCL5通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

主要結(jié)論：

本研究發(fā)現(xiàn)CRC腫瘤芽分泌高水平的CCL5，CCL5通過CCR5- SLC25A24信號征集成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致侵襲前沿腫瘤芽周圍形成特征性成纖維細(xì)胞簇。這進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤血管生成和膠原合成，促進(jìn)了惡性進(jìn)展（圖6k）。因此，該研究為CCL5可能作為CRC腫瘤出芽的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點提供了證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Gao LF, Zhong Y, Long T, Wang X, Zhu JX, Wang XY, Hu ZY, Li ZG. Tumor bud-derived CCL5 recruits fibroblasts and promotes colorectal cancer progression via CCR5-SLC25A24 signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41:81.