腫瘤芽來源的CCL5招募成纖維細(xì)胞，通過CCR5-SLC25A24信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展

腫瘤出芽在結(jié)直腸癌（CRC）的常規(guī)診斷中，被認(rèn)為是獨(dú)立于TNM分期的腫瘤預(yù)后因素。近日，有研究發(fā)現(xiàn)：在結(jié)直腸癌（CRC）的侵襲前沿，腫瘤芽源性趨化因子配體5（CCL5）可以通過CCR5 SLC25A24信號(hào)招募成纖維細(xì)胞，通過招募的成纖維細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)血管生成和膠原合成，最終形成促腫瘤微環(huán)境（TME）。因此，CCL5可能成為CRC腫瘤出芽的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CRC腫瘤細(xì)胞可將成纖維細(xì)胞招募到腫瘤芽中

作者使用H&E染色對(duì)195個(gè)臨床CRC組織樣本進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，CRC癌組織浸潤(rùn)前沿的腫瘤出芽比未出芽的其他腫瘤部位有更多的成纖維細(xì)胞（圖1a）。腫瘤芽周圍的成纖維細(xì)胞顯示出α-SMA和CD90的高表達(dá)，但FAP的低表達(dá)（α-SMA^high CD90 ^high FAP^low）（圖1b）。這些結(jié)果表明，CRC組織浸潤(rùn)前沿的腫瘤出芽與成纖維細(xì)胞異質(zhì)性密切相關(guān)。作者又通過檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-cadherin、成纖維細(xì)胞標(biāo)記物vimentin和α-SMA來鑒定成纖維細(xì)胞（圖1c）。

通過共培養(yǎng)招募試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FHC（人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系）和LS174T、RKO、DLD-1、Caco2（人CRC細(xì)胞系）具有較弱的招募成纖維細(xì)胞的能力。相比之下，HCT-8、HCT116、HCT-15和SW620（人CRC細(xì)胞株）表現(xiàn)出更強(qiáng)的招募能力（圖1d和e）。由于HCT116細(xì)胞在體外表現(xiàn)出強(qiáng)大的招募成纖維細(xì)胞的能力，被用于進(jìn)一步的活體原位CRC異種移植小鼠實(shí)驗(yàn)。使用H&E染色檢查小鼠盲腸中的腫瘤，觀察到HCT116也可以在體內(nèi)招募成纖維細(xì)胞（圖1f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CRC的腫瘤芽可以招募成纖維細(xì)胞。

圖1結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞可將成纖維細(xì)胞招募到腫瘤芽中

2. 腫瘤芽中的CRC腫瘤細(xì)胞通過CCL5招募成纖維細(xì)胞

為了進(jìn)一步確定結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞募集的原因，使用人類細(xì)胞因子陣列進(jìn)行分析（圖2a）。GO功能富集分析表明，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與各種活動(dòng)（圖2b）。這表明，CRC腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以招募TME中的其他細(xì)胞，并可能參與招募成纖維細(xì)胞，而成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。

在差異表達(dá)的蛋白中，CCL5在人類CRC腫瘤細(xì)胞的CM樣本中表達(dá)最多（圖2c）。在FHC和8個(gè)人CRC腫瘤細(xì)胞株中檢測(cè)CCL5的mRNA和分泌蛋白水平，結(jié)果與共培養(yǎng)招募試驗(yàn)的初步結(jié)果完全一致（圖2d, e）。此外，CCD-18Co和人類原代正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞分泌的CCL5水平低于FHC（圖2f）。因此，CCL5介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的招募似乎是通過旁分泌而不是自分泌信號(hào)發(fā)生的。接下來，用免疫組化法檢測(cè)人CRC組織中CCL5的表達(dá)，結(jié)果顯示CCL5在侵襲前部的腫瘤芽中高表達(dá)（圖2g）。為了檢驗(yàn)CCL5是否為成纖維細(xì)胞招募的關(guān)鍵細(xì)胞因子，再次進(jìn)行招募實(shí)驗(yàn)（圖2h）。CCL5可以招募到CCD-18Co和不同的人類原代正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞（圖2i）。最后，為了確定招募成纖維細(xì)胞的CCL5是否由CRC腫瘤細(xì)胞分泌，分別用siRNA和慢病毒構(gòu)建了CCL5敲除和過表達(dá)的細(xì)胞系。共培養(yǎng)招募實(shí)驗(yàn)（圖2j）顯示，敲除CCL5后，腫瘤細(xì)胞招募成纖維細(xì)胞的能力明顯減弱（圖2k）。相比之下，當(dāng)CCL5過表達(dá)時(shí)，這種能力增強(qiáng)（圖2l）。招募分析，CM樣本穩(wěn)定細(xì)胞（圖2m）顯示效果類似于觀察整個(gè)細(xì)胞（圖2 n, o）。這些結(jié)果表明CCL5在CRC腫瘤芽中高度表達(dá)，并能從TME招募成纖維細(xì)胞。

圖2腫瘤芽中的CRC腫瘤細(xì)胞通過CCL5募集成纖維細(xì)胞

3. CCL5通過CCR5受體招募成纖維細(xì)胞

為了探究CCL5是否通過它的受體介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的招募，使用siRNA分別下調(diào)它們?cè)诔衫w維細(xì)胞中的表達(dá)，并驗(yàn)證了干擾效率（圖3a, b）。接下來，進(jìn)行招募檢測(cè)，如圖3c所示：只有在成纖維細(xì)胞中下調(diào)CCR5才能顯著減弱CCL5招募成纖維細(xì)胞的能力（圖3d）。

此外，在共培養(yǎng)招募試驗(yàn)之前和期間，分別使用CCR1抑制劑BX471和CCR5抑制劑Maraviroc治療成纖維細(xì)胞，并阻斷CCR1和CCR5（圖3e）。只有Maraviroc治療顯著削弱了CCL5招募成纖維細(xì)胞的能力（圖3f）。以上結(jié)果強(qiáng)烈表明CCL5通過CCR5受體參與成纖維細(xì)胞招募。

圖3 CCL5通過CCR5受體招募成纖維細(xì)胞

4. 在成纖維細(xì)胞中，SLC25A24介導(dǎo)CCL5依賴的成纖維細(xì)胞補(bǔ)充

為了探究CCL5刺激后成纖維細(xì)胞的胞內(nèi)變化，使用CCL5治療前后的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖4a）。選取差異表達(dá)前20個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證：在CCL5治療后，SLC25A24 mRNA水平在人類原代正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞中上調(diào)（圖4b）。

采用IF法檢測(cè)SLC25A24蛋白在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)和定位。結(jié)果顯示，SLC25A24在侵襲前部腫瘤芽周圍的成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)（圖4c）。在體內(nèi)，在sh-CCL5轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞的腫瘤異種移植中，觀察到成纖維細(xì)胞中SLC25A24的表達(dá)減少（圖4d）。

功能上，為了探索CCL5介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞招募是否依賴于SLC25A24，將抗SLC25A24的siRNA轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行招募實(shí)驗(yàn)（圖4e）。成纖維細(xì)胞中SLC25A24表達(dá)的減少顯著削弱了CCL5招募成纖維細(xì)胞的能力（圖4f, g）。這表明CCL5介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞招募依賴于SLC25A24和CCR5。

KEGG富集分析表示PI3K-Akt信號(hào)通路在CCL5刺激后最為活躍（圖4h）。免疫印跡結(jié)果顯示，CCL5可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞Akt和mTOR的磷酸化（圖4i，左圖）。相比之下，當(dāng)SLC25A24的表達(dá)被抑制時(shí)，CCL5刺激后成纖維細(xì)胞磷酸化的Akt和mTOR水平下降（圖4i，右圖）。這些發(fā)現(xiàn)表明CCL5通過成纖維細(xì)胞中的SLC25A24- pAkt-pmTOR軸招募成纖維細(xì)胞。

圖4成纖維細(xì)胞中SLC25A24介導(dǎo)CCL5依賴性成纖維細(xì)胞補(bǔ)充

5. CCL5有助于增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤血管生成

最初發(fā)現(xiàn)（圖1b）證明腫瘤芽周圍的成纖維細(xì)胞是α-SMA^high, CD90^high和FAP^low。為了檢驗(yàn)CCL5是否是增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞的主要原因，進(jìn)行了IF試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)CCL5處理的成纖維細(xì)胞中α-SMA和CD90的表達(dá)升高（圖5a）。下一步研究CCL5在成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成中的作用。免疫印跡顯示CCL5處理后成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮標(biāo)志物FLI1、VE-cadherin、CD31、VEGFA水平以及α-SMA和CD90水平升高（圖5b）。流式細(xì)胞術(shù)也顯示，在CCL5刺激后，VE-cadherin⁺成纖維細(xì)胞亞群的比例增加（圖5c）。CCL5刺激后增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的促血管生成能力（圖5d）。在侵襲性前沿，CCL5在腫瘤芽中高表達(dá)，腫瘤芽被大量的α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞和血管包圍（圖5e）。綜上，腫瘤芽源CCL5增加了α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞的數(shù)量，并通過增加VEGFA和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤血管生成。

圖5 CCL5有助于增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤血管生成

6. CCL5通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

GO功能富集分析表明，CCL5也參與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)功能（圖6a）。WB分析顯示CCL5可以增加體外成纖維細(xì)胞中COL1和COL3的蛋白表達(dá)（圖6b）。臨床樣本中，CRC組織中CCL5的表達(dá)明顯高于正常組織（圖6c）。采用Pearson’s^χ2檢驗(yàn)分析CCL5表達(dá)與臨床特征之間的相關(guān)性（表1）。進(jìn)一步的Spearman相關(guān)性試驗(yàn)表明，CCL5高水平表達(dá)與腫瘤芽增加的高風(fēng)險(xiǎn)（圖6 d）呈正相關(guān)。此外，對(duì)195例人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的88例進(jìn)行了COL1和COL3染色，以檢測(cè)膠原分布。結(jié)果顯示結(jié)腸結(jié)直腸癌組織中COL1和COL3表達(dá)升高（圖6e）。采用Pearson’s^χ2檢驗(yàn)分析Sirius Red染色與CRC臨床特征的相關(guān)性（表2）。進(jìn)一步的Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，CRC腫瘤細(xì)胞周圍膠原蛋白的高分布與腫瘤芽的增加呈正相關(guān)（圖6f）。CCL5在侵襲性前緣腫瘤芽中的高表達(dá)往往伴隨著膠原合成的增加（圖6g）。Spearman相關(guān)性分析顯示，同一CRC組織樣本中，腫瘤細(xì)胞中CCL5的表達(dá)水平與周圍膠原蛋白的數(shù)量呈正相關(guān)（圖6h）。

隨后，利用分泌大量CCL5的HCT116細(xì)胞建立原位CRC異種移植小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)分析。發(fā)現(xiàn)侵襲性前沿的腫瘤細(xì)胞周圍膠原合成增加（圖6i）。利用人CRC基因芯片圖譜GSE39582分析COL1或COL3低表達(dá)和高表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存期：COL1和COL3的高表達(dá)與CRC患者預(yù)后不良密切相關(guān)（圖6j）。綜上所述，腫瘤芽分泌CCL5，然后通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

圖6 CCL5通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

主要結(jié)論：

本研究發(fā)現(xiàn)CRC腫瘤芽分泌高水平的CCL5，CCL5通過CCR5- SLC25A24信號(hào)征集成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致侵襲前沿腫瘤芽周圍形成特征性成纖維細(xì)胞簇。這進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤血管生成和膠原合成，促進(jìn)了惡性進(jìn)展（圖6k）。因此，該研究為CCL5可能作為CRC腫瘤出芽的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Gao LF, Zhong Y, Long T, Wang X, Zhu JX, Wang XY, Hu ZY, Li ZG. Tumor bud-derived CCL5 recruits fibroblasts and promotes colorectal cancer progression via CCR5-SLC25A24 signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41:81.