單細(xì)胞測序分析挖掘心球衍生細(xì)胞的起源和特性

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-03-31
本研究使用單細(xì)胞RNA測序(sc-RNAseq)研究了CDCs與心臟非肌細(xì)胞和非造血細(xì)胞(心臟成纖維細(xì)胞/CFs、平滑肌細(xì)胞/SMCs和......


從人類心臟活組織中產(chǎn)生的心球衍生細(xì)胞(CDCs)在臨床試驗(yàn)中已被證明具有疾病修飾的生物活性。矛盾的是,CDCs在心臟的細(xì)胞起源仍然難以捉摸。本研究使用單細(xì)胞RNA測序(sc-RNAseq)研究了CDCs與心臟非肌細(xì)胞和非造血細(xì)胞(心臟成纖維細(xì)胞/CFs、平滑肌細(xì)胞/SMCs和內(nèi)皮細(xì)胞/ECs)的分子特性??傊?,CDCs是一種富含線粒體的細(xì)胞,具有獨(dú)特的特性,但也與右心房CFs相似。CDCs表現(xiàn)出高度增殖、分泌和免疫調(diào)節(jié)的特性,這些特性也可在活化或炎癥細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)。通過特殊的培養(yǎng)條件,CDCs獲得一些生物活性,包括血管生成潛力,這可以改變某些疾病的異常。 本研究于2022年3月發(fā)表在《Basic Research in Cardiology》IF:17.165雜志上。

 

技術(shù)路線如下:


主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

1、成人CDCs的特征與其他原發(fā)性非肌細(xì)胞類型相比

CDCs分離自接受心臟手術(shù)的成人右心耳組織,并通過包括生長因子刺激在內(nèi)的“3D心球”建立的(Fig. 1A)。為了評估CDCs不同的分子譜,將其與心臟成纖維細(xì)胞(CFs)、平滑肌細(xì)胞(SMCs)、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和脂肪組織來源成纖維細(xì)胞(AFs)等非心臟細(xì)胞類型進(jìn)行比較。分別從心臟脂肪組織和皮下脂肪組織中分離出CFs和AFs(Fig. 1A)。冠狀動脈搭橋術(shù)(CABG)患者的胸廓血管生成ECs和SMCs(Fig. 1A)。

首先qRT-PCR檢測了這些細(xì)胞類型的表面標(biāo)志物以驗(yàn)證是否分離正確(Fig. 1B–F)。隨后免疫細(xì)胞化學(xué)染色或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步評價選定標(biāo)志物的蛋白水平(Fig. 1G–L)??傊@些結(jié)果表明CDCs表現(xiàn)出與非肌細(xì)胞類型相似的分子特征。然而,CDCs明顯不同于真正的心臟祖細(xì)胞(DIFF D6)和未成熟的心肌細(xì)胞(DIFF D8)。描述良好的CDCs標(biāo)記物,如CD105,在AFs、CF、SMCs和ECs中均有表達(dá)。

 

1與其他原發(fā)性非肌細(xì)胞類型相比,成人CDC的特征

 

2、CDCs的單細(xì)胞RNA測序與主要的心臟非肌細(xì)胞類型進(jìn)行比較

對CDCs細(xì)胞,和3中主要的心臟非肌細(xì)胞CF、SMCs和ECs進(jìn)行單細(xì)胞測序。圖2A根據(jù)細(xì)胞標(biāo)識描述了細(xì)胞類型。對于CDCs,CF、SMCs和ECs,鑒定了上調(diào)的前10個基因(Fig. 2B)。CFs、SMCs、ECs和CDCs的無監(jiān)督全局聚類根據(jù)其特定的基因表達(dá)將其細(xì)分為11個不同的聚類,從視覺上看,所有細(xì)胞類型都分裂成兩個主要的簇,有時還會有進(jìn)一步的亞簇,特別是對于CDCs來說,分為了5個亞簇(Fig. 2C)。為了更好地了解CDCs,研究了五個CDsC亞簇集群的GSEA。所有的細(xì)胞群都表現(xiàn)出主要的免疫調(diào)節(jié)特性,如“對細(xì)胞因子的反應(yīng)” (Fig. 2D)。主要集群Cl4/7/3和Cl5/8兩者之間的主要區(qū)別CDCs的Cl5/8似乎參與更有活力過程(線粒體,細(xì)胞呼吸,F(xiàn)ig. 2D)。為了更好地了解CDCs與CFs、ECs或SMCs之間是否存在顯著的相似性,計(jì)算細(xì)胞相似性。在CDCs的樣本中出現(xiàn)了三個峰,其中,峰值明顯,第二峰值與CFs和SMCs相似度得分大致相同,最小峰值與SMC曲線的小峰平行(Fig. 2E)。到目前為止,sc-RNAseq結(jié)果顯示CDCs表現(xiàn)出最多的線粒體基因,并以分泌和免疫調(diào)節(jié)特征區(qū)別于CFs、SMCs和ECs。然而,CDCs也顯示出與非肌細(xì)胞類型的某些相似之處。

 

3CDCs的單細(xì)胞RNA測序與分化的hESCs進(jìn)行比較

為了更詳細(xì)地比較CDCs與真正的心臟祖細(xì)胞(CPCs)和早期心肌細(xì)胞(CMs),納入了分化的人ESCs (hESCs)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以在hESC分化過程中繪制譜系決定的軌跡圖。hESC DIFF D6/D7/D8/D9/D15進(jìn)行整合并生成UMAP(Fig. 2F, G)。無監(jiān)督聚類產(chǎn)生了8個聚類(Fig. 2G)。CDCs與CPCs或TBX5、GATA4和NKX2-5明顯標(biāo)記的早期CMs無重疊(Fig. 2F-H)。此外,CDCs與上皮細(xì)胞(群集5)或血管生成祖細(xì)胞(群集7)沒有重疊(Fig. 2F, G)。然而,CDCs在簇中與分化的hESCs重疊,顯示CF- (cluster 2)或增殖細(xì)胞(cluster 0,6)的特征(Fig. 2F, G)。有趣的是,早期定義的CDCs標(biāo)志物如CXCL1、CXCL6和IL1B(圖2B)在這種情況下對CDCs具有高度特異性(Fig. 2I)。綜上所述,通過比較CDCs和分化的hESCs的sc-RNAseq數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)其與心臟祖細(xì)胞或早期心肌細(xì)胞沒有重疊。

2CDCs的單細(xì)胞RNA測序與主要的心臟非肌細(xì)胞類型(CFs、SMCs、ECs)和分化的hESCs進(jìn)行比較。

 

4、sc-RNAseqCDCs和右心房活檢的比較

接下來,試圖闡明CDCs在成人心臟中的起源細(xì)胞群。因此,使用來自四個不同個體的右心房人活組織切片,并進(jìn)行了單核(RA-1, RA-2)或單細(xì)胞(RA-3,單核(sn) RNAseq數(shù)據(jù)。心肌細(xì)胞(CMs) 單核(sn) RNAseq數(shù)據(jù)用的是前人的研究。將Sn-sc-RNAseq活檢數(shù)據(jù)與成人CDC sc-RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,生成UMAP圖。首先,單細(xì)胞和單細(xì)胞核很好地聚集在一起,因此能夠在四個活檢樣本中識別所有主要的心臟細(xì)胞類型:CMs、CFs、ECs、SMCs/周細(xì)胞(PCs)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(MPs)和B-/ t細(xì)胞(Fig. 3A–C)。新的CDCs標(biāo)志物CXCL1/6/8和IL1B(圖2B)也在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)(CXCL6除外)( Fig. 3C)。有趣的是,CDCs位于CFs附近(Fig. 3A、B)。77%的CDCs甚至共享CF-1集群。23%的CDCs建立了自己的集群(Cl7: CDC-2)。與CF相比,CMs離CDCs較遠(yuǎn),EC和周細(xì)胞/SMCs離CDCs更遠(yuǎn)。

因此,推測CDCs可能是CF細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。為了驗(yàn)證這一點(diǎn),試圖使用單細(xì)胞軌跡分析。在CDCs的兩個集群中(Cl7: CDC和Cl2: CF-1/CDC),檢測到三個軌跡分支(編號為1、2和3) (Fig. 3D)。CDCs和CFs建立了三個主要的軌跡,其中cdc在偽空間的一端,CFs在另一端。為了了解其軌跡分支,研究了相關(guān)基因。為此,作者在Seurat中進(jìn)行了額外的亞群分析,并分析了聚類0(映射到軌跡1)、7(映射到軌跡2)和12(映射到軌跡3)中的前25個特定基因(Fig. 3E)。GSEA表明,軌跡1主要與External encapsulating structure和ECM organization有關(guān)。軌跡2與locomotion and development有關(guān)。軌跡3,CDCs軌跡,與response to cytokine,immune system processes,secretion有關(guān)。

3 sc-/sn- RNAseqCDC和人心房活檢的比較。

 

5、成人與嬰兒CDCs的分子特征比較

對來自新生兒或成人心房的人心肌細(xì)胞的再臨床研究表明,在免疫缺陷梗死大鼠心臟移植后,新生兒心肌細(xì)胞比成人心肌細(xì)胞具有更強(qiáng)的修復(fù)能力。新生兒CDCs維持心肌功能,防止不良重塑,促進(jìn)血管生成。所以作者試圖闡明成人與嬰兒CDCs的分子特征的區(qū)別。有趣的是,基因表達(dá)分析顯示,與成人CDCs和嬰兒CFs相比,嬰兒CFs中心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA4和TBX5的表達(dá)較低(Fig. 4A)。相比之下,NKX2-5在嬰兒組(CDCs和CFs)的表達(dá)顯著升高。CF標(biāo)記物ALDH1A2在兩個年齡組中與嬰兒細(xì)胞相比在成人細(xì)胞中上調(diào),與CDCs相比在CF中上調(diào),S100A4在兩個年齡組中,與CFs比較,都是在CDCs中上調(diào),THY1 (CD90)也是如此(Fig. 4B)。CXCL6在兩個年齡組的CDCs中均具有特異性,而miR-146a僅在嬰兒組中與CFs相比在CDCs中具有特異性(Fig. 4C)。兩個CDCs樣本(嬰兒和成人,圖4D)的無監(jiān)督全局聚類,根據(jù)其特定的基因表達(dá)將CDCs細(xì)分為6個聚類(Fig. 4E)。在嬰兒和成人樣本之間主要有兩組(0,3)重疊(Fig. 4F)。通過計(jì)算細(xì)胞相似性,證實(shí)了嬰兒和成人CDCs樣本具有較高的相似性(Fig. 4G)。有趣的是,GSEA揭示了兩個集群的具有幾個相似的GO分類(Fig. 4H)。這些結(jié)果sc-RNAseq分析顯示新生兒CDCs參與心臟發(fā)育過程,而成人CDCs更多地參與免疫調(diào)節(jié)和分泌。

4成人與嬰兒CDCs的分子特征比較。

 

6、CDCsCF來源的細(xì)胞外囊泡(EV)介導(dǎo)的旁分泌效應(yīng)

分析CDCs的旁分泌作用,如促進(jìn)血管生成和抗纖維化作用或抑制心肌細(xì)胞凋亡。將不同細(xì)胞來源的EV和不同類型的心肌細(xì)胞共孵育,檢測心肌細(xì)胞的管腔形成,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與CF-EV比較,CDC-EV顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞血管生成和運(yùn)動能力(Fig. 5A–I)。

5 CDCCF來源的細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的旁分泌效應(yīng)。

 

綜上所述,本研究對培養(yǎng)的人原代細(xì)胞(CF、SMCs、ECsCDCs)進(jìn)行Sc-RNAseq分析,揭示了其分子特性的詳細(xì)圖像。CDCs是一種線粒體豐富的細(xì)胞類型(線粒體基因含量高),與CFsSMCsECs的區(qū)別主要在于其分泌和免疫調(diào)節(jié)特性(Fig. 6)。

6 CDCs的分子鑒定

 

參考文獻(xiàn):

Kogan, PS., Wirth, F., Tomar, A. et al. Uncovering the molecular identity of cardiosphere-derived cells (CDCs) by single-cell RNA sequencing. Basic Res Cardiol 117, 11 (2022). https://doi-org.blk.80599.net/10.1007/s00395-022-00913-y