Let-7i-5p通過抑制腫瘤抑制性自噬促進(jìn)鼻咽癌的惡性表型

miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，識別與miRNA和治療靶點相關(guān)的惡性表型將有助于改善鼻咽癌（NPC）的治療。在這項研究中，我們證明let-7i-5p的過表達(dá)通過靶向NPC中的ATG10和ATG16L1從而促進(jìn)惡性表型。根據(jù)對GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的分析，let-7i-5p在鼻咽癌和頭頸癌中的表達(dá)水平顯著升高。通過對150例鼻咽癌組織的隊列研究，我們發(fā)現(xiàn)let-7i-5p與晚期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良臨床結(jié)果相關(guān)。除了一系列體外細(xì)胞分析外，體內(nèi)小鼠腫瘤模型顯示let-7i-5p通過靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬并促進(jìn)NPC的惡性表型。我們的研究結(jié)果表明，let-7i-5p可能是鼻咽癌治療的一個有希望的治療靶點。本文于2022年1月發(fā)表于“Cancer Letters”（IF= 8.679）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）Let-7i-5p在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平升高，并與不良臨床結(jié)果相關(guān)

為了評估NPC miRNA表達(dá)譜，使用GEO數(shù)據(jù)庫（GSE70970）對246個腫瘤組織和17個非腫瘤組織的微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。這些數(shù)據(jù)顯示，33個miRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著改變。排名前1-17位的候選基因是EBV相關(guān)的miRNA，第18位是let-7i-5p，它在NPC組織中顯著增加，引起了我們的注意（圖1A）。TCGA數(shù)據(jù)庫查詢用于確認(rèn)let-7i-5p在頭頸癌中的表達(dá)增加（圖1B和C）。為了評估let-7i-5p在鼻咽癌中的作用，我們使用鼻咽癌組織芯片進(jìn)行了原位雜交并進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，let-7i-5p在終末期疾病患者中顯著上調(diào)，包括臨床IV期、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖1D-G）。Kaplan–Meier分析顯示，let-7i-5p高表達(dá)患者的總生存率（OS）和無進(jìn)展生存率（DFS）低于let-7i-5p低表達(dá)患者（圖1H和I）。這些結(jié)果表明let-7i-5p的過表達(dá)在NPC進(jìn)展中作為癌基因發(fā)揮作用，并代表一個有價值的預(yù)后生物標(biāo)志物。

2）Let-7i-5p在體外促進(jìn)鼻咽癌的遷移和增殖

通過一系列細(xì)胞分析進(jìn)一步探討了let-7i-5p在鼻咽癌中的致癌作用。首先，使用qRT–PCR測定NPC細(xì)胞系和非癌鼻咽上皮細(xì)胞系NP69中的let-7i-5p水平。let-7i-5p在所有NPC細(xì)胞系中顯著過表達(dá)（圖2A）。因為CNE-2和5-8F細(xì)胞系的表達(dá)量最高，所以它們被用來研究let-7i-5p對鼻咽癌細(xì)胞的直接影響。在用let-7i-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后，測定干擾效率以確認(rèn)生成具有低let-7i-5p表達(dá)的細(xì)胞（圖2B和C）。然后使用傷口愈合試驗、Transwell試驗、菌落形成試驗、EdU試驗和流式細(xì)胞術(shù)來確定let-7i-5p對NPC細(xì)胞生長和遷移的影響。根據(jù)傷口愈合和Transwell分析，let-7i-5p下調(diào)抑制了細(xì)胞遷移（圖2D-G）。此外，基于增殖特性實驗，包括集落分析、EdU和流式細(xì)胞術(shù)，let-7i-5p敲除抑制NPC細(xì)胞的增殖能力（圖2H-M）。這些發(fā)現(xiàn)表明let-7i-5p在體外調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和增殖。

3）干擾let-7i-5p表達(dá)抑制體內(nèi)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和增殖能力

為了確定let-7i-5p是否在體內(nèi)促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移和生長，我們建立了小鼠腫瘤異種移植和腫瘤轉(zhuǎn)移模型。在敲除let-7i-5p后，將細(xì)胞接種到裸鼠腋窩，以評估let-7i-5p對細(xì)胞生長的影響（圖3A）。移植后21天，切除異種移植腫瘤并稱重。let-7i-5p低表達(dá)的細(xì)胞增殖減少（圖3B和C）。此后，我們使用小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型來評估NPC轉(zhuǎn)移。通過尾靜脈將具有l(wèi)et-7i-5p抑制或?qū)φ盏募?xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。在實驗期間，通過每3天測量一次生物發(fā)光來監(jiān)測轉(zhuǎn)移。注射后45天，NC組的三只裸鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，而let-7i-5p基因敲除組的小鼠沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移（圖3D和E）。肺組織的HE染色顯示，let-7i-5p低表達(dá)的小鼠表現(xiàn)出減少的癌癥病變（圖3F）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明let-7i-5p可加速鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和生長。

4）Let-7i-5p抑制鼻咽癌細(xì)胞自噬活性

由于一些自噬相關(guān)的miRNA已被報道可加速惡性表型，我們研究了let-7i-5p是否調(diào)節(jié)NPC自噬活性。我們發(fā)現(xiàn)沉默let-7i-5p表達(dá)導(dǎo)致LC3聚集的顯著誘導(dǎo)，表明自噬體形成增加（圖4A-D）。然后使用串聯(lián)單體mRFP-GFP標(biāo)記的LC3來確定let-7i-5p在自噬通量中的作用。如圖4E-F所示，let-7i-5p基因敲除后，黃色熒光自噬體和紅色熒光自溶體的數(shù)量顯著增加（圖4E-F）。與單獨使用氯喹（CQ）治療相比，CQ和let-7i-5p敲除聯(lián)合治療導(dǎo)致黃色熒光自噬體進(jìn)一步累積（圖4E-F）。這些結(jié)果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌細(xì)胞自噬體的形成和自噬通量。此外，通過免疫印跡檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-I、LC3-II、自噬底物p62和自噬相關(guān)基因ATG5。我們觀察到，隨著let-7i-5p基因敲除，ATG5和LC3-II表達(dá)增加，p62水平降低（圖4G-J）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌細(xì)胞的自噬活性。

5）ATG10和ATG16L1是let-7i-5p的直接靶點

最近的研究表明，miRNA可以通過靶向自噬相關(guān)基因來調(diào)節(jié)自噬，從而影響惡性轉(zhuǎn)化。因此，我們探索了let-7i-5p是否也通過靶向自噬相關(guān)基因來調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的自噬水平。使用生物信息學(xué)工具和兩個miRNA數(shù)據(jù)庫，740個基因被確定為let-7i-5p的潛在靶點（圖5A）。為了進(jìn)一步確定let-7i-5p調(diào)節(jié)自噬的靶基因，我們在對740個預(yù)測候選基因進(jìn)行KEGG通路分析后，重點研究了自噬相關(guān)通路（圖5B）。在12個自噬相關(guān)靶點中，自噬相關(guān)基因10（ATG10）和自噬相關(guān)基因16 L（ATG16L）因其在調(diào)節(jié)自噬中的直接作用而被選中。通過將目標(biāo)基因（WT-3′UTR）的3′UTR或突變序列（mut-3′UTR）克隆到熒光素酶質(zhì)粒中，使用熒光素酶報告基因分析驗證了let-7i-5p與ATG10和ATG16L的3’-UTR之間的生物有效相互作用（圖5C）。let-7i-5p、ATG10和ATG16L的潛在結(jié)合位點如圖5D所示。此外，在let-7i-5p缺失的鼻咽癌細(xì)胞和異種移植瘤中，ATG10和ATG16L1表達(dá)水平顯著升高(圖5E-H)。在缺乏let-7i-5p的細(xì)胞中，ATG12（ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物的一部分）的表達(dá)增加，而在ATG8中未觀察到明顯變化（圖5E-F）。由LC3表達(dá)確定的自噬活性證實了let-7i-5p對自噬的影響（圖5G-H）。這些數(shù)據(jù)清楚地表明ATG10和ATG16L是let-7i-5p的直接目標(biāo)。

6）ATG10和ATG16L1對于let-7i-5p促進(jìn)惡性NPC表型至關(guān)重要

為了研究ATG10和ATG16L1是否逆轉(zhuǎn)let-7i-5p誘導(dǎo)的NPC惡性表型，我們進(jìn)行了體外和體內(nèi)拯救實驗。ATG10和/或ATG16L1的敲除消除了let-7i-5p抑制增加細(xì)胞遷移和增殖的能力（圖6A-C）。此外，小鼠異種移植瘤實驗結(jié)果顯示，let-7i-5p抑制降低了鼻咽癌細(xì)胞的增殖；然而，這種效應(yīng)在ATG10和ATG16L1抑制后降低（圖6D-E），表明let-7i-5p促進(jìn)惡性表型取決于其抑制ATG10和ATG16L1表達(dá)的能力（圖6F-G）。這些結(jié)果表明let-7i-5p的促腫瘤作用需要自噬相關(guān)基因ATG10和ATG16L1。

結(jié)論：我們的研究揭示了let-7i-5p通過靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬來促進(jìn)惡性表型的機制。我們的數(shù)據(jù)表明，let-7i-5p水平在鼻咽癌晚期顯著升高，有助于預(yù)測臨床結(jié)果。我們的研究為基于let-7i-5p的鼻咽癌分子治療策略的制定提供了潛在的臨床應(yīng)用和新的方向。

參考文獻(xiàn)：

You B, Zhang P, Gu M, Yin H, Fan Y, Yao H, Pan S, Xie H, Cheng T, Liu H, You Y, Liu J. Let-7i-5p promotes a malignant phenotype in nasopharyngeal carcinoma via inhibiting tumor-suppressive autophagy. Cancer Lett. 2022 Jan 29;531:14-26. doi: 10.1016/j.canlet.2022.01.019.