Let-7i-5p通過抑制腫瘤抑制性自噬促進(jìn)鼻咽癌的惡性表型

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-04-01
體內(nèi)小鼠腫瘤模型顯示let-7i-5p通過靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬并促進(jìn)NPC的惡性表型。我們的研究結(jié)果表明,let-7i-5p可能是......


miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此,識別與miRNA和治療靶點(diǎn)相關(guān)的惡性表型將有助于改善鼻咽癌(NPC)的治療。在這項(xiàng)研究中,我們證明let-7i-5p的過表達(dá)通過靶向NPC中的ATG10ATG16L1從而促進(jìn)惡性表型。根據(jù)對GEOTCGA數(shù)據(jù)庫的分析,let-7i-5p在鼻咽癌和頭頸癌中的表達(dá)水平顯著升高。通過對150例鼻咽癌組織的隊(duì)列研究,我們發(fā)現(xiàn)let-7i-5p與晚期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良臨床結(jié)果相關(guān)。除了一系列體外細(xì)胞分析外,體內(nèi)小鼠腫瘤模型顯示let-7i-5p通過靶向ATG10ATG16L1抑制自噬并促進(jìn)NPC的惡性表型。我們的研究結(jié)果表明,let-7i-5p可能是鼻咽癌治療的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。本文于20221月發(fā)表于“Cancer Letters”IF= 8.679)上。

 

技術(shù)路線


結(jié)果

1Let-7i-5p在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平升高,并與不良臨床結(jié)果相關(guān)

為了評估NPC miRNA表達(dá)譜,使用GEO數(shù)據(jù)庫(GSE70970)對246個(gè)腫瘤組織和17個(gè)非腫瘤組織的微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。這些數(shù)據(jù)顯示,33個(gè)miRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著改變。排名前1-17位的候選基因是EBV相關(guān)的miRNA,第18位是let-7i-5p,它在NPC組織中顯著增加,引起了我們的注意(圖1A)。TCGA數(shù)據(jù)庫查詢用于確認(rèn)let-7i-5p在頭頸癌中的表達(dá)增加(圖1B和C)。為了評估let-7i-5p在鼻咽癌中的作用,我們使用鼻咽癌組織芯片進(jìn)行了原位雜交并進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,let-7i-5p在終末期疾病患者中顯著上調(diào),包括臨床IV期、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1D-G)。Kaplan–Meier分析顯示,let-7i-5p高表達(dá)患者的總生存率(OS)和無進(jìn)展生存率(DFS)低于let-7i-5p低表達(dá)患者(圖1H和I)。這些結(jié)果表明let-7i-5p的過表達(dá)在NPC進(jìn)展中作為癌基因發(fā)揮作用,并代表一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物。


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Let-7i-5p在體外促進(jìn)鼻咽癌的遷移和增殖

通過一系列細(xì)胞分析進(jìn)一步探討了let-7i-5p在鼻咽癌中的致癌作用。首先,使用qRT–PCR測定NPC細(xì)胞系和非癌鼻咽上皮細(xì)胞系NP69中的let-7i-5p水平。let-7i-5p在所有NPC細(xì)胞系中顯著過表達(dá)(圖2A)。因?yàn)镃NE-2和5-8F細(xì)胞系的表達(dá)量最高,所以它們被用來研究let-7i-5p對鼻咽癌細(xì)胞的直接影響。在用let-7i-5p抑制劑轉(zhuǎn)染后,測定干擾效率以確認(rèn)生成具有低let-7i-5p表達(dá)的細(xì)胞(圖2B和C)。然后使用傷口愈合試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)、菌落形成試驗(yàn)、EdU試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)來確定let-7i-5p對NPC細(xì)胞生長和遷移的影響。根據(jù)傷口愈合和Transwell分析,let-7i-5p下調(diào)抑制了細(xì)胞遷移(圖2D-G)。此外,基于增殖特性實(shí)驗(yàn),包括集落分析、EdU和流式細(xì)胞術(shù),let-7i-5p敲除抑制NPC細(xì)胞的增殖能力(圖2H-M)。這些發(fā)現(xiàn)表明let-7i-5p在體外調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和增殖。


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)干擾let-7i-5p表達(dá)抑制體內(nèi)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和增殖能力

為了確定let-7i-5p是否在體內(nèi)促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移和生長,我們建立了小鼠腫瘤異種移植和腫瘤轉(zhuǎn)移模型。在敲除let-7i-5p后,將細(xì)胞接種到裸鼠腋窩,以評估let-7i-5p對細(xì)胞生長的影響(圖3A)。移植后21天,切除異種移植腫瘤并稱重。let-7i-5p低表達(dá)的細(xì)胞增殖減少(圖3B和C)。此后,我們使用小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型來評估NPC轉(zhuǎn)移。通過尾靜脈將具有l(wèi)et-7i-5p抑制或?qū)φ盏募?xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)期間,通過每3天測量一次生物發(fā)光來監(jiān)測轉(zhuǎn)移。注射后45天,NC組的三只裸鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移,而let-7i-5p基因敲除組的小鼠沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移(圖3D和E)。肺組織的HE染色顯示,let-7i-5p低表達(dá)的小鼠表現(xiàn)出減少的癌癥病變(圖3F)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明let-7i-5p可加速鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和生長。


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Let-7i-5p抑制鼻咽癌細(xì)胞自噬活性

由于一些自噬相關(guān)的miRNA已被報(bào)道可加速惡性表型,我們研究了let-7i-5p是否調(diào)節(jié)NPC自噬活性。我們發(fā)現(xiàn)沉默let-7i-5p表達(dá)導(dǎo)致LC3聚集的顯著誘導(dǎo),表明自噬體形成增加(圖4A-D)。然后使用串聯(lián)單體mRFP-GFP標(biāo)記的LC3來確定let-7i-5p在自噬通量中的作用。如圖4E-F所示,let-7i-5p基因敲除后,黃色熒光自噬體和紅色熒光自溶體的數(shù)量顯著增加(圖4E-F)。與單獨(dú)使用氯喹(CQ)治療相比,CQ和let-7i-5p敲除聯(lián)合治療導(dǎo)致黃色熒光自噬體進(jìn)一步累積(圖4E-F)。這些結(jié)果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌細(xì)胞自噬體的形成和自噬通量。此外,通過免疫印跡檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-I、LC3-II、自噬底物p62和自噬相關(guān)基因ATG5。我們觀察到,隨著let-7i-5p基因敲除,ATG5和LC3-II表達(dá)增加,p62水平降低(圖4G-J)??偟膩碚f,這些結(jié)果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌細(xì)胞的自噬活性。


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ATG10ATG16L1let-7i-5p的直接靶點(diǎn)

最近的研究表明,miRNA可以通過靶向自噬相關(guān)基因來調(diào)節(jié)自噬,從而影響惡性轉(zhuǎn)化。因此,我們探索了let-7i-5p是否也通過靶向自噬相關(guān)基因來調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的自噬水平。使用生物信息學(xué)工具和兩個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫,740個(gè)基因被確定為let-7i-5p的潛在靶點(diǎn)(圖5A)。為了進(jìn)一步確定let-7i-5p調(diào)節(jié)自噬的靶基因,我們在對740個(gè)預(yù)測候選基因進(jìn)行KEGG通路分析后,重點(diǎn)研究了自噬相關(guān)通路(圖5B)。在12個(gè)自噬相關(guān)靶點(diǎn)中,自噬相關(guān)基因10(ATG10)和自噬相關(guān)基因16 L(ATG16L)因其在調(diào)節(jié)自噬中的直接作用而被選中。通過將目標(biāo)基因(WT-3′UTR)的3′UTR或突變序列(mut-3′UTR)克隆到熒光素酶質(zhì)粒中,使用熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證了let-7i-5p與ATG10和ATG16L的3’-UTR之間的生物有效相互作用(圖5C)。let-7i-5p、ATG10和ATG16L的潛在結(jié)合位點(diǎn)如圖5D所示。此外,在let-7i-5p缺失的鼻咽癌細(xì)胞和異種移植瘤中,ATG10和ATG16L1表達(dá)水平顯著升高(圖5E-H)。在缺乏let-7i-5p的細(xì)胞中,ATG12(ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物的一部分)的表達(dá)增加,而在ATG8中未觀察到明顯變化(圖5E-F)。由LC3表達(dá)確定的自噬活性證實(shí)了let-7i-5p對自噬的影響(圖5G-H)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明ATG10和ATG16L是let-7i-5p的直接目標(biāo)。


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ATG10ATG16L1對于let-7i-5p促進(jìn)惡性NPC表型至關(guān)重要

為了研究ATG10和ATG16L1是否逆轉(zhuǎn)let-7i-5p誘導(dǎo)的NPC惡性表型,我們進(jìn)行了體外和體內(nèi)拯救實(shí)驗(yàn)。ATG10和/或ATG16L1的敲除消除了let-7i-5p抑制增加細(xì)胞遷移和增殖的能力(圖6A-C)。此外,小鼠異種移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,let-7i-5p抑制降低了鼻咽癌細(xì)胞的增殖;然而,這種效應(yīng)在ATG10和ATG16L1抑制后降低(圖6D-E),表明let-7i-5p促進(jìn)惡性表型取決于其抑制ATG10和ATG16L1表達(dá)的能力(圖6F-G)。這些結(jié)果表明let-7i-5p的促腫瘤作用需要自噬相關(guān)基因ATG10和ATG16L1。


結(jié)論:
我們的研究揭示了let-7i-5p通過靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬來促進(jìn)惡性表型的機(jī)制。我們的數(shù)據(jù)表明,let-7i-5p水平在鼻咽癌晚期顯著升高,有助于預(yù)測臨床結(jié)果。我們的研究為基于let-7i-5p的鼻咽癌分子治療策略的制定提供了潛在的臨床應(yīng)用和新的方向。

參考文獻(xiàn):

You B, Zhang P, Gu M, Yin H, Fan Y, Yao H, Pan S, Xie H, Cheng T, Liu H, You Y, Liu J. Let-7i-5p promotes a malignant phenotype in nasopharyngeal carcinoma via inhibiting tumor-suppressive autophagy. Cancer Lett. 2022 Jan 29;531:14-26. doi: 10.1016/j.canlet.2022.01.019.