三張結(jié)果圖發(fā)10.9分神刊，不服來辯！

谷氨酰胺酶(GLS)同工酶GLS1和GLS2催化谷氨酰胺分解的第一步。GLS1是Th17分化的必要條件，其抑制作用可抑制動物自身免疫性疾病，但GLS2的功能尚不清楚。本研究旨在探討GLS2在CD4+ T細(xì)胞功能和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病機制中的作用。本研究結(jié)果表明，GLS2通過支持抗氧化防御，在CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并提供了一種新的方法來糾正SLE中T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。本研究于2022年3月發(fā)表在《Arthritis Rheumatology》IF:10.995期刊上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、在CD4+ T細(xì)胞中GLS2通過表觀遺傳降低ROS水平并增加IL-2的產(chǎn)生

GLS2在多種癌癥細(xì)胞系中被報道可降低ROS水平。為了評估GLS2是否降低CD4+T細(xì)胞中ROS水平，對na?ve CD4+ T細(xì)胞加以CD3和CD28抗體刺激，并轉(zhuǎn)染空白載體、GLS1和GLS2過表達載體。結(jié)果如圖1A所示，過表達GLS2而不是GLS1可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。高水平ROS會早知脂質(zhì)過氧化最終導(dǎo)致線粒體紊亂。和預(yù)期一致，GLS2過表達減少了CD4+T細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化（圖1B）。Mitotracker Deep red和Green staining組合染色結(jié)果顯示CD4+T細(xì)胞中GLS2過表達降低了線粒體去極化的細(xì)胞組分（圖1C）。

此前，有研究表明使用NAC處理，一種ROS清除劑和GSH前體，可顯著減少T細(xì)胞中ROS水平并增加IL-2的產(chǎn)生，用其治療SLE患者可抑制疾病相關(guān)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達GLS2而非GLS1顯著增加了CD4+T細(xì)胞IL-2啟動子的活性和細(xì)胞上清中IL-2的濃度（圖1D-1E）。由于IL-2表達是由IL-2基因啟動子的CpG-DNA甲基化控制，所以作者進一步評估了IL-2基因啟動子的CpG-DNA甲基化?；诖饲皥蟮篮托蛄械谋Ｊ匦?，作者關(guān)注4個甲基化區(qū)域（圖1F）。過表達GLS2而非GLS1，導(dǎo)致CpG-DNA甲基化位點CNS1，CNS2，CNS3而非CNS4顯著下降（圖1G）。

總之，這些結(jié)果證實過表達GLS2而不是GLS1，顯著降低CD4+T細(xì)胞的ROS水平，脂質(zhì)過氧化和線粒體異常，并增加IL-2的產(chǎn)生。

圖1在CD4+ T細(xì)胞中GLS2降低ROS水平并增加IL-2的產(chǎn)生

2、PDZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序是 GLS2 介導(dǎo)的 ROS 和 IL-2 調(diào)節(jié)的必要條件

為理解GLS2和GLS1的差別是如何存在的，作者關(guān)注于兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。GLS2和GLS1的主要氨基酸序列排列都比較相近，而最大的差別在于它們的C端和N端。與GLS1不同，GLS2的C端有一個PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序，它可以與含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合（圖2A）。據(jù)此，作者推測，GLS2對IL-2和ROS的調(diào)控依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用通過PDZ結(jié)構(gòu)域。為了這個目的，作者構(gòu)建了GLS2過表達載體，但其中PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序被相應(yīng)的GLS1序列取代（圖2A）。有趣的是，突變PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序后導(dǎo)致GLS2對ROS水平、脂質(zhì)過氧化、線粒體異常的降低作用和對IL-2啟動子活性的回復(fù)作用均顯著減弱（圖2B-2E）。總之，這些結(jié)果表明PDZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序是 GLS2 介導(dǎo)的 ROS 和 IL-2 調(diào)節(jié)的必要條件。

圖2GLS2介導(dǎo)的IL-2和ROS調(diào)控需要PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域

3、GLS2 可降低來自狼瘡易發(fā)小鼠和 SLE 患者的 CD4+ T 細(xì)胞的ROS 水平并恢復(fù)產(chǎn)生 IL-2

CD4+ T 細(xì)胞中 IL-2 產(chǎn)生不足和細(xì)胞質(zhì) ROS 水平升高是 SLE 發(fā)展的關(guān)鍵因素。如圖3A和3B所示，與對照鼠和健康人中分理出的CD4+ T 細(xì)胞比較，SLE模型鼠和SLE患者中分離出的CD4+ T 細(xì)胞中GLS2蛋白表達水平顯著下降。此外，有無CD3和CD28抗體刺激的小鼠和人CD4+ T細(xì)胞中GLS2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明GLS2在狼瘡T細(xì)胞中下降不是由于激活T細(xì)胞的增加。接下來，作者轉(zhuǎn)染GLS1和GLS2過表達載體至SLE模型鼠和SLE患者分離出的CD4+T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，過表達GLS2而非GLS1，顯著降低CD4+T細(xì)胞ROS水平，并回復(fù)IL-2啟動子活性（圖3C-3F）。這些結(jié)果說明GLS2糾正SLE來源CD4+T細(xì)胞的ROS的異常并回復(fù)IL2產(chǎn)生至正常水平。

圖3 GLS2恢復(fù)CD4+ T細(xì)胞中IL-2的產(chǎn)生并降低的ROS水平，這些細(xì)胞來自有紅斑狼瘡傾向的小鼠和SLE患者

參考文獻：

Hisada Ryo., Yoshida Nobuya., Orite Seo Yeon K., Umeda Masataka., Burbano Catalina., Scherlinger Marc., Kono Michihito., Krishfield Suzanne., Tsokos George C.(2022). Glutaminase 2 Promotes Interleukin-2 Production in CD4 T cells by Supporting Antioxidant Defense. Arthritis Rheumatol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1002/art.42112