TIGAR通過ROS/AMPK/SCD1途徑驅(qū)動結(jié)直腸癌鐵死亡抗性

結(jié)直腸癌（CRC）是世界上第三常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因。鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。越來越多的證據(jù)表明，鐵死亡在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究確定TIGAR是CRC發(fā)展過程中抗鐵死亡的潛在調(diào)節(jié)因子。我們發(fā)現(xiàn)TIGAR在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。TIGAR敲除顯著增加了erastin誘導(dǎo)的SW620和HCT116細(xì)胞鐵死亡。值得注意的是，TIGAR敲除顯著降低了GSH/GSSG比率，增加了脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，促進(jìn)了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的積累，并使CRC細(xì)胞對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡更加敏感。此外，TIGAR抑制以氧化還原和AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達(dá)。因此，這些結(jié)果表明TIGAR通過ROS/AMPK/SCD1信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡抗性。本文于2022年3月發(fā)表于“Free Radical Biology And Medicine”（IF= 7.376）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）TIGAR在結(jié)腸癌中高表達(dá)

我們首先分析了TIGAR在不同細(xì)胞和非腫瘤組織中的表達(dá)模式。應(yīng)用TNMplot分析TIGAR在不同腫瘤類型TCGA中的表達(dá)狀態(tài)。如圖1A所示，TIGAR在乳腺、結(jié)腸、肝臟、肺、胃、前列腺、皮膚、腎臟等腫瘤組織中的表達(dá)水平高于相應(yīng)的鄰近正常組織。接下來，從TCGA數(shù)據(jù)庫中研究TIGAR在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)。如圖1B所示，未配對和配對分析均表明，與相鄰正常組相比，結(jié)腸癌腫瘤組織中TIGAR mRNA表達(dá)上調(diào)，以及TCGA數(shù)據(jù)庫中各個(gè)癌癥階段的TIGAR mRNA表達(dá)上調(diào)。UALCAN的CPTAC數(shù)據(jù)集的結(jié)果顯示，結(jié)腸癌原發(fā)組織中TIGAR總蛋白的表達(dá)高于癌旁正常組織（圖1B）。此外，我們還檢測了一組結(jié)腸癌細(xì)胞中TIGAR的mRNA和蛋白。與正常結(jié)直腸細(xì)胞系NCM460相比，SW620、HCT116和DLD1細(xì)胞中TIGAR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)（圖1C和D）?？傊?span style="background: yellow;">這些數(shù)據(jù)表明TIGAR在CRC的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。

2）鐵死亡與CRC的發(fā)展有關(guān)

我們研究了478例COAD患者TIGAR的生物學(xué)功能?；蚣患治觯?/span>GSEA）表明，許多與TIGAR相關(guān)的基因位于鐵死亡、氧化磷酸化和脂肪酸代謝中（NES>1.8, FDR<0.05）。（圖2A）。在這項(xiàng)研究中，我們分析了在結(jié)腸癌組織和正常鄰近組織中調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵基因的差異表達(dá)。結(jié)果表明，TCGA數(shù)據(jù)庫中22個(gè)基因在結(jié)腸癌組織和正常癌旁組織中的表達(dá)存在顯著差異。熱圖分析結(jié)果顯示，LPCAT3、ACO1、IREB2、NCOA4和HMOX1在結(jié)腸癌細(xì)胞中下調(diào)（圖2B）。而SLC3A2和GPX4在結(jié)腸癌細(xì)胞中上調(diào)（圖2B）。此外，我們在TCGA數(shù)據(jù)庫中使用UALCAN對鐵死亡的關(guān)鍵基因進(jìn)行分類，并分析其在CRC組織和正常相鄰組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常鄰近組織相比，CRC組織中SLC7A11、GPX4、ACSL4、TFRC和SLC11A2表達(dá)上調(diào)，而HMOX1、LPCAT3、ALOX12和SLC40A1表達(dá)下調(diào)(圖2C)。所有這些都表明，很多與鐵死亡相關(guān)的基因在結(jié)腸癌組織中異常表達(dá)。

3）鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin對結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響

為了確定erastin在結(jié)腸癌細(xì)胞活力中的作用，我們首先在五種結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1、HT29、HCT116、SW480和SW620中測量了erastin對細(xì)胞活力的影響。我們發(fā)現(xiàn)erastin以劑量相關(guān)的方式抑制細(xì)胞增殖（圖3A）。為了進(jìn)一步證實(shí)erastin對結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響，選擇2μM erastin處理不同的結(jié)腸癌細(xì)胞。HT29和SW480對2μM erastin處理的erastin誘導(dǎo)的鐵死亡高度敏感；DLD1、HCT116和SW620對經(jīng)2μM erastin處理的鐵死亡具有抵抗力（圖3B）。由于SW620和HCT116細(xì)胞在所測試的CRC細(xì)胞系中具有最高水平的TIGAR，因此在以下實(shí)驗(yàn)中選擇了HCT116和SW620細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明TIGAR可能與HCT116和SW620細(xì)胞的鐵死亡抗性有關(guān)。

4）TIGAR敲除增強(qiáng)erastin誘導(dǎo)的SW620和HCT116細(xì)胞死亡

盡管TIGAR在氧化還原和代謝調(diào)節(jié)中起著重要作用，但對于TIGAR在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗鐵死亡性知之甚少。為了探討TIGAR對結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡的影響，在HCT116和SW620細(xì)胞中用shRNA#1和#2敲除TIGAR。RT-qPCR和western blot證實(shí)，在HCT116和SW620細(xì)胞中，TIGAR的mRNA（圖4A）和蛋白質(zhì)（圖4B）表達(dá)顯著下調(diào)。為了研究TIGAR在結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡中的作用，用MTS法和細(xì)胞死亡法對HCT116和SW620細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡進(jìn)行了評估。HCT116和SW620細(xì)胞用鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和鐵死亡抑制劑ferrostatin-1處理24小時(shí)。如圖4C所示，TIGAR的敲除顯著增加了erastin誘導(dǎo)的生長抑制，這種效應(yīng)可通過HCT116和SW620細(xì)胞中的ferrostatin-1逆轉(zhuǎn)。類似地，erastin治療增加了TIGAR敲除的HCT116和SW620細(xì)胞的細(xì)胞死亡，ferrostatin-1治療逆轉(zhuǎn)了TIGAR敲除的HCT116和SW620細(xì)胞的細(xì)胞死亡水平（圖4D）。這些結(jié)果表明，TIGAR敲除增加了HCT116和SW620細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，TIGAR是鐵死亡的潛在負(fù)調(diào)節(jié)因子。

5）TIGAR敲除促進(jìn)HCT116和SW620細(xì)胞的鐵死亡

脂質(zhì)過氧化和鐵積累是鐵死亡的兩個(gè)主要生化特征。C11-BODIPY染色流式細(xì)胞術(shù)檢測脂質(zhì)過氧化。如圖5A所示，shTIGAR#1和#2對TIGAR的敲除顯著降低了經(jīng)erastin處理的HCT116和SW620細(xì)胞中的GSH/GSSG比率。此外，我們還進(jìn)一步研究了TIGAR敲除對脂質(zhì)過氧化和脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）的影響。結(jié)果顯示，shTIGAR#1和#2對TIGAR的敲除顯著增加了HCT116和SW620細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和MDA水平（圖5B和C）。有趣的是，在TIGAR敲除細(xì)胞中，鐵的相對水平?jīng)]有明顯變化（圖5D）。結(jié)果提示TIGAR敲除可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡。

6）TIGAR敲除以ROS/AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達(dá)

AMPK是細(xì)胞能量水平的關(guān)鍵傳感器，協(xié)調(diào)多種代謝途徑以維持能量平衡，包括脂質(zhì)代謝。為了進(jìn)一步確定TIGAR在脂質(zhì)過氧化中的作用機(jī)制，我們研究了TIGAR對AMPK信號通路的影響。如圖6A所示，在HCT116和SW620細(xì)胞中，TIGAR的敲除顯著誘導(dǎo)AMPK的激活和SCD1表達(dá)的下調(diào)。為了了解AMPK信號通路的潛在作用，將AMPK抑制劑化合物C用于HCT116和SW620細(xì)胞。TIGAR敲除導(dǎo)致SCD1蛋白表達(dá)降低，而SCD1的蛋白表達(dá)隨著化合物C的處理而增加（圖6B）。化合物C的處理顯著增加了TIGAR敲除HCT116和SW620細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖6C）。這些結(jié)果表明，敲除TIGAR可以以AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達(dá)，從而促進(jìn)鐵死亡。

7）TIGAR敲除以氧化還原依賴的方式抑制SCD1的表達(dá)

在以前的研究中，TIGAR顯示出強(qiáng)大的抗氧化作用，并顯著降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。用DCFH-DA和DHR123流式細(xì)胞術(shù)觀察活性氧。在erastin治療后，TIGAR敲除增加了ROS水平（圖7A）。為了進(jìn)一步證明TIGAR通過活性氧影響鐵死亡，我們在HCT116和SW620細(xì)胞中添加了抗氧化劑NAC。在HCT116和SW620細(xì)胞中，TIGAR敲除導(dǎo)致SCD1的減少和p-AMPK蛋白表達(dá)的增加，而NAC處理使SCD1的蛋白表達(dá)增加，p-AMPK的蛋白表達(dá)降低（圖7B）。NAC治療顯著降低了TIGAR敲除的HCT116和SW620細(xì)胞的細(xì)胞死亡（圖7C）。這些結(jié)果表明TIGAR通過ROS/AMPK調(diào)節(jié)增強(qiáng)了結(jié)腸癌細(xì)胞對鐵死亡的抵抗力。

結(jié)論：我們的工作揭示了TIGAR抑制結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)腸癌細(xì)胞中TIGAR的缺失通過增加ROS產(chǎn)生和促進(jìn)ROS/AMPK介導(dǎo)的SCD1下調(diào)表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)過氧化。因此，靶向TIGAR可能是一種潛在的基于鐵死亡的結(jié)腸癌的治療方法。

參考文獻(xiàn)：

Liu MY, Li HM, Wang XY, Xia R, Li X, Ma YJ, Wang M, Zhang HS. TIGAR drives colorectal cancer ferroptosis resistance through ROS/AMPK/SCD1 pathway. Free Radic Biol Med. 2022 Mar 7;182:219-231. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2022.03.002.