microRNA-142通過控制Treg細胞穩(wěn)態(tài)和功能來對抗自身免疫

調(diào)節(jié)性T (T_reg)細胞在預防異常的免疫反應中起關鍵作用，microRNA (miRNA)對基因表達的轉(zhuǎn)錄后控制已成為T_reg細胞功能的重要遺傳因素。目前，有研究發(fā)現(xiàn)miR-142作為T_reg細胞穩(wěn)態(tài)不可或缺的調(diào)節(jié)因子，通過減弱IFNγ反應發(fā)揮其功能。該研究于2022年2月發(fā)表在《PLoS biology》，IF：8.029。

技術路線：

主要研究結果：

1. T_reg細胞特異性miR-142缺失小鼠的致死性自身免疫疾病

作者前期發(fā)現(xiàn)miR-142在T細胞中動態(tài)表達，其整體消融導致T_reg細胞特異性缺陷。為了確定miR-142在T_reg細胞功能中的作用，構建T_reg細胞特異性消融miR-142的小鼠(Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠)。Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙：壽命短（圖1A），體型較?。▓D1B），體重顯著低于野生型（WT;Foxp3^Cre）同窩小鼠（圖1C）。形態(tài)學分析顯示，Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠出現(xiàn)了系統(tǒng)性淋巴增生性自身免疫性疾病，其特征為顯著的淋巴結病(圖1D)，輕度脾腫大(圖1D)，皮炎(圖1B)，以及大量免疫細胞浸潤到周圍器官(圖1E)。綜上所述，Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠的表型結果與嚴重T_reg細胞缺陷小鼠的自身免疫病理相似，提示miR-142參與調(diào)節(jié)T_reg細胞穩(wěn)態(tài)或穩(wěn)定性。

圖1 T_reg細胞特異性破壞miR-142小鼠的致命自身免疫性疾病

2. Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠的Treg細胞缺損和T細胞異常激活

Foxp3^CremiR-142^fl/fl脾臟中T_reg細胞數(shù)量顯著減少(圖2A)。用流式細胞儀檢測了Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠外周血T細胞的激活狀態(tài)：與WT老鼠相比，CD4 +和CD8 + T細胞的數(shù)量與內(nèi)存/效應表型(CD44^hiCD62L^lo)明顯高于在脾臟和淋巴結Foxp3^CremiR-142^fl/fl的老鼠，而在KO動物中，原始的(CD44^loCD62L^hi) CD4 +和CD8 + T細胞大大減少(圖2 B和2C)。此外，從Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中分離的CD4+和CD8+ T細胞都顯示出IFNγ的產(chǎn)生急劇增加(圖2D和2E)。因此，條件下敲除miR-142會損害T_reg細胞的功能，進而導致T_eff反應的嚴重失調(diào)。

圖2 miR-142是維持T_reg細胞介導的免疫耐受所必需的

3. miR-142對于T_reg細胞的穩(wěn)態(tài)和抑制活性至關重要

將純化的缺失miR-142和充足miR-142的T_reg細胞與經(jīng)抗原受體刺激誘導增殖的WT T_conv細胞共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)與miR-142充足的T_reg細胞相比，miR-142不足的T_reg細胞表現(xiàn)出抑制活化T_conv細胞增殖的能力(圖3A)。另外，用來自C57BL/6的同種異體CD4+ T_conv細胞(H2^b)移植的BALB/c小鼠(H2^d)受到致命照射后，迅速發(fā)生亞致死aGVHD，表現(xiàn)為宿主小鼠駝背、嚴重腹瀉和體重減輕(圖3B和3C)。WT T_reg細胞與異體供體T細胞同時移植可減輕宿主小鼠的腹瀉和體重減輕(圖3C)，從而減輕aGVHD癥狀的嚴重程度。相比之下，miR-142缺失的T_reg細胞未能保護宿主小鼠免受aGVHD的發(fā)展，并可能通過加劇炎癥反應導致死亡(圖3B和3C)，這表明miR-142在調(diào)節(jié)體內(nèi)T_reg細胞抑制活性中起著重要作用。此外，移植后17天，宿主小鼠脾臟中供體miR-142缺陷型T_reg細胞的頻率顯著降低（圖3D），表明miR-142缺陷型T_reg細胞的存活或體內(nèi)平衡缺陷。

為了測試miR-142消融是否影響T_reg細胞的存活，比較miR-142充分和miR-142缺乏的T_reg細胞對TCR刺激的誘導凋亡。發(fā)現(xiàn)純化的脾miR-142 KO T_reg細胞更容易激活誘導細胞死亡（圖3E）。此外，鑲嵌小鼠脾臟YFP+miR-142缺陷型T_reg細胞的頻率顯著降低（圖3F），表明miR-142在T_reg細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮細胞自主作用。此外，BrdU體內(nèi)標記實驗顯示，miR-142缺失的T_reg細胞的增殖能力幾乎比WT T_reg細胞低2倍(圖3G)。miR-142缺失的T_reg細胞表現(xiàn)出幾種t細胞激活標志物的上調(diào) (圖3H)。并且在miR-142缺失的T_reg細胞中，保護T_reg細胞免受凋亡的程序性死亡-1 (PD-1)受體的水平顯著降低(圖3H)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-142在調(diào)節(jié)T_reg細胞的穩(wěn)態(tài)維持和增殖中起重要作用。

圖3 miR-142消融會損害T_reg細胞的抑制功能和穩(wěn)態(tài)

4. T_reg細胞中miR-142的特異性缺失導致miR-142-3p靶點的整體抑制

為了揭示miR-142控制T_reg細胞功能的分子機制，使用RNA測序?qū)ζ?/span>CD4+YFP+ miR-142充足和miR-142缺乏的T_reg細胞進行了整體轉(zhuǎn)錄組分析：共1520個基因在miR-142消融后表達發(fā)生統(tǒng)計學顯著變化，在miR-142缺失的T_reg細胞中，988個基因表達上調(diào)，532個基因表達下調(diào)(圖4A)。另外，miR-142缺陷的T_reg細胞中的差異表達基因進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-142-3p顯著富集，而miR-142-5p在上調(diào)基因中的直接靶基因中沒有顯著富集(圖4B)。提示Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，T_reg細胞穩(wěn)態(tài)和功能受損很可能是由于成熟miR-142-3p表達缺失所致。根據(jù)Enrichment軟件算法和基因集富集分析(GSEA) (圖4C)，miR-142缺失的T_reg細胞中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本富集了來自IFNγ信號網(wǎng)絡的基因。同樣地，miR-142缺失的T_reg細胞與WT細胞相比產(chǎn)生了更多的IFNγ(圖4D和4E)，IFNγ信號轉(zhuǎn)導失調(diào)，表現(xiàn)為Stat1激活顯著增加(圖4D和4E)。另外，檢測IFNγ刺激對T_reg細胞存活的影響，發(fā)現(xiàn)IFNγ處理顯著增強了miR-142缺失的T_reg細胞的體外凋亡(圖4G和4H)。

圖4 miR-142缺失的T_reg細胞中，miR-142-3p靶點整體去抑制和IFNγ信號異常

5. Ifng消融可挽救Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠的T_reg穩(wěn)態(tài)缺陷并緩解系統(tǒng)性自身免疫性疾病的發(fā)展

為了確定IFNγ信號異常如何影響miR-142缺陷的T_reg細胞的穩(wěn)態(tài)，構建Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng /雙KO小鼠。在雙KO小鼠中，T_reg穩(wěn)態(tài)缺陷完全恢復(圖5A)。此外，Ifng缺失減輕了Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠系統(tǒng)性淋巴增生性和致命自身免疫性疾病的發(fā)展。這一結論在Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng /小鼠上得到支持（圖5B-F）。需要注意的是，雙KO小鼠顯示出組織炎癥減輕，免疫細胞浸潤到外周組織的數(shù)量明顯減少(圖5G)。這些形態(tài)學變化與Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng/小鼠周圍naive T_conv細胞數(shù)量的適度增加相關(圖5H)，表明miR-142-IFNγ信號軸對維持T_reg細胞穩(wěn)態(tài)至關重要。盡管Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng/小鼠中T_reg細胞頻率恢復，但雙KO小鼠中剩余的CD4+ T轉(zhuǎn)換細胞過度激活暗示miR-142在調(diào)節(jié)T_reg細胞免疫抑制活性中可能發(fā)揮作用。

圖5在Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，阻斷IFNγ的產(chǎn)生可以修復Treg細胞穩(wěn)態(tài)缺陷并減輕系統(tǒng)自身免疫

6. miR-142-3p靶向多種IFNγ相關基因

在miR-142缺失的T_reg細胞中，幾個與IFNγ相關的基因被TargetScan算法預測為miR-142-3p的假定直接靶點(圖4C)。對HITS-CLIP數(shù)據(jù)庫的擴展分析顯示，缺氧誘導因子1 alpha (Hif1a)是miR-142-3p的潛在靶點(圖6A)。通過熒光素酶報告基因檢測，證實了miR-142-3p通過直接結合的3'-UTR序列來減弱Hif1a和Ifnγr2表達的能力(圖6B)。同時，miR-142缺失的T_reg細胞中Hif1α和IFNγR2蛋白水平顯著升高，而CD4+T_conv細胞中Hif1α表達保持不變(圖6C)。但是在缺乏miR-142表達的T_reg細胞中，沒有觀察到Hif1a mRNA表達的變化。

圖6在Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，降低Hif1a基因劑量可部分恢復T_reg群體的正常大小，并減弱外周血T細胞的過度激活

7. 在Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，Hif1a單倍體不足挽救了T_reg細胞穩(wěn)態(tài)缺陷

為了確定miR-142-Hif1a軸在T_reg細胞穩(wěn)態(tài)和功能中的作用，通過將Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠與攜帶條件性Hif1a等位基因（Hif1a^fl/fl）的小鼠雜交，降低了miR-142缺陷型T_reg細胞中Hif1a基因的劑量，產(chǎn)生的Foxp3^CremiR-142^fl/flHif1a^+/fl小鼠顯示T_reg細胞豐度的部分恢復（圖6D）。此外，Foxp3^CremiR-142^fl/flHif1a^+/fl小鼠顯示出外圍激活/效應CD4+ T細胞頻率的部分降低(圖6E和6F)。

結論

miR-142作為T_reg細胞發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和抑制活性的中心調(diào)節(jié)因子，部分通過限制IFNγ的產(chǎn)生和應答來介導其在T_reg細胞中的功能。該研究促進對T_reg細胞生物學的理解，這些新的見解可能為癌癥免疫治療和自身免疫性疾病中T_reg細胞活性的靶向藥理操作開辟新的途徑。