microRNA-142通過控制Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能來對(duì)抗自身免疫

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-04-15
目前,有研究發(fā)現(xiàn)miR-142作為Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)不可或缺的調(diào)節(jié)因子,通過減弱IFNγ反應(yīng)發(fā)揮其功能。該研究于......


調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞在預(yù)防異常的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,microRNA (miRNA)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后控制已成為Treg細(xì)胞功能的重要遺傳因素。目前,有研究發(fā)現(xiàn)miR-142作為Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)不可或缺的調(diào)節(jié)因子,通過減弱IFNγ反應(yīng)發(fā)揮其功能。該研究于20222月發(fā)表在《PLoS biology》,IF8.029


技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:

1. Treg細(xì)胞特異性miR-142缺失小鼠的致死性自身免疫疾病

作者前期發(fā)現(xiàn)miR-142T細(xì)胞中動(dòng)態(tài)表達(dá),其整體消融導(dǎo)致Treg細(xì)胞特異性缺陷。為了確定miR-142Treg細(xì)胞功能中的作用,構(gòu)建Treg細(xì)胞特異性消融miR-142的小鼠(Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠)。Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙:壽命短(圖1A),體型較?。▓D1B),體重顯著低于野生型(WT;Foxp3Cre)同窩小鼠(圖1C)。形態(tài)學(xué)分析顯示,Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠出現(xiàn)了系統(tǒng)性淋巴增生性自身免疫性疾病,其特征為顯著的淋巴結(jié)病(1D),輕度脾腫大(1D),皮炎(1B),以及大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官(1E)。綜上所述,Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠的表型結(jié)果與嚴(yán)重Treg細(xì)胞缺陷小鼠的自身免疫病理相似,提示miR-142參與調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或穩(wěn)定性。

1 Treg細(xì)胞特異性破壞miR-142小鼠的致命自身免疫性疾病


2.
Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠的Treg細(xì)胞缺損和T細(xì)胞異常激活

Foxp3CremiR-142fl/fl脾臟中Treg細(xì)胞數(shù)量顯著減少(2A)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠外周血T細(xì)胞的激活狀態(tài):與WT老鼠相比,CD4 +CD8 + T細(xì)胞的數(shù)量與內(nèi)存/效應(yīng)表型(CD44hiCD62Llo)明顯高于在脾臟和淋巴結(jié)Foxp3CremiR-142fl/fl的老鼠,而在KO動(dòng)物中,原始的(CD44loCD62Lhi) CD4 +CD8 + T細(xì)胞大大減少(2 B2C)。此外,從Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠中分離的CD4+CD8+ T細(xì)胞都顯示出IFNγ的產(chǎn)生急劇增加(2D2E)。因此,條件下敲除miR-142會(huì)損害Treg細(xì)胞的功能,進(jìn)而導(dǎo)致Teff反應(yīng)的嚴(yán)重失調(diào)。

2 miR-142是維持Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受所必需的


3.
miR-142對(duì)于Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和抑制活性至關(guān)重要

將純化的缺失miR-142和充足miR-142Treg細(xì)胞與經(jīng)抗原受體刺激誘導(dǎo)增殖的WT Tconv細(xì)胞共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)與miR-142充足的Treg細(xì)胞相比,miR-142不足的Treg細(xì)胞表現(xiàn)出抑制活化Tconv細(xì)胞增殖的能力(3A)。另外,用來自C57BL/6的同種異體CD4+ Tconv細(xì)胞(H2b)移植的BALB/c小鼠(H2d)受到致命照射后,迅速發(fā)生亞致死aGVHD,表現(xiàn)為宿主小鼠駝背、嚴(yán)重腹瀉和體重減輕(3B3C)WT Treg細(xì)胞與異體供體T細(xì)胞同時(shí)移植可減輕宿主小鼠的腹瀉和體重減輕(3C),從而減輕aGVHD癥狀的嚴(yán)重程度。相比之下,miR-142缺失的Treg細(xì)胞未能保護(hù)宿主小鼠免受aGVHD的發(fā)展,并可能通過加劇炎癥反應(yīng)導(dǎo)致死亡(3B3C),這表明miR-142在調(diào)節(jié)體內(nèi)Treg細(xì)胞抑制活性中起著重要作用。此外,移植后17天,宿主小鼠脾臟中供體miR-142缺陷型Treg細(xì)胞的頻率顯著降低(圖3D),表明miR-142缺陷型Treg細(xì)胞的存活或體內(nèi)平衡缺陷。

為了測(cè)試miR-142消融是否影響Treg細(xì)胞的存活,比較miR-142充分和miR-142缺乏的Treg細(xì)胞對(duì)TCR刺激的誘導(dǎo)凋亡。發(fā)現(xiàn)純化的脾miR-142 KO Treg細(xì)胞更容易激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(圖3E)。此外,鑲嵌小鼠脾臟YFP+miR-142缺陷型Treg細(xì)胞的頻率顯著降低(圖3F),表明miR-142Treg細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮細(xì)胞自主作用。此外,BrdU體內(nèi)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示,miR-142缺失的Treg細(xì)胞的增殖能力幾乎比WT Treg細(xì)胞低2(3G)。miR-142缺失的Treg細(xì)胞表現(xiàn)出幾種t細(xì)胞激活標(biāo)志物的上調(diào) (3H)。并且在miR-142缺失的Treg細(xì)胞中,保護(hù)Treg細(xì)胞免受凋亡的程序性死亡-1 (PD-1)受體的水平顯著降低(3H)??偟膩碚f,這些發(fā)現(xiàn)表明miR-142在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持和增殖中起重要作用。

3 miR-142消融會(huì)損害Treg細(xì)胞的抑制功能和穩(wěn)態(tài)


4.
Treg細(xì)胞中miR-142的特異性缺失導(dǎo)致miR-142-3p靶點(diǎn)的整體抑制

為了揭示miR-142控制Treg細(xì)胞功能的分子機(jī)制,使用RNA測(cè)序?qū)ζ?/span>CD4+YFP+ miR-142充足和miR-142缺乏的Treg細(xì)胞進(jìn)行了整體轉(zhuǎn)錄組分析:共1520個(gè)基因在miR-142消融后表達(dá)發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化,在miR-142缺失的Treg細(xì)胞中,988個(gè)基因表達(dá)上調(diào),532個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(4A)。另外,miR-142缺陷的Treg細(xì)胞中的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-142-3p顯著富集,而miR-142-5p在上調(diào)基因中的直接靶基因中沒有顯著富集(4B)。提示Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠中,Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能受損很可能是由于成熟miR-142-3p表達(dá)缺失所致。根據(jù)Enrichment軟件算法和基因集富集分析(GSEA) (4C),miR-142缺失的Treg細(xì)胞中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本富集了來自IFNγ信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的基因。同樣地,miR-142缺失的Treg細(xì)胞與WT細(xì)胞相比產(chǎn)生了更多的IFNγ(4D4E),IFNγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào),表現(xiàn)為Stat1激活顯著增加(4D4E)。另外,檢測(cè)IFNγ刺激對(duì)Treg細(xì)胞存活的影響,發(fā)現(xiàn)IFNγ處理顯著增強(qiáng)了miR-142缺失的Treg細(xì)胞的體外凋亡(4G4H)。

4 miR-142缺失的Treg細(xì)胞中,miR-142-3p靶點(diǎn)整體去抑制和IFNγ信號(hào)異常


5.
Ifng消融可挽救Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠的Treg穩(wěn)態(tài)缺陷并緩解系統(tǒng)性自身免疫性疾病的發(fā)展

為了確定IFNγ信號(hào)異常如何影響miR-142缺陷的Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),構(gòu)建Foxp3CremiR-142fl/flIfng /KO小鼠。在雙KO小鼠中,Treg穩(wěn)態(tài)缺陷完全恢復(fù)(5A)。此外,Ifng缺失減輕了Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠系統(tǒng)性淋巴增生性和致命自身免疫性疾病的發(fā)展。這一結(jié)論在Foxp3CremiR-142fl/flIfng /小鼠上得到支持(圖5B-F)。需要注意的是,雙KO小鼠顯示出組織炎癥減輕,免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到外周組織的數(shù)量明顯減少(5G)。這些形態(tài)學(xué)變化與Foxp3CremiR-142fl/flIfng/小鼠周圍naive Tconv細(xì)胞數(shù)量的適度增加相關(guān)(5H),表明miR-142-IFNγ信號(hào)軸對(duì)維持Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。盡管Foxp3CremiR-142fl/flIfng/小鼠中Treg細(xì)胞頻率恢復(fù),但雙KO小鼠中剩余的CD4+ T轉(zhuǎn)換細(xì)胞過度激活暗示miR-142在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞免疫抑制活性中可能發(fā)揮作用。

5Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠中,阻斷IFNγ的產(chǎn)生可以修復(fù)Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)缺陷并減輕系統(tǒng)自身免疫


6.
miR-142-3p靶向多種IFNγ相關(guān)基因

miR-142缺失的Treg細(xì)胞中,幾個(gè)與IFNγ相關(guān)的基因被TargetScan算法預(yù)測(cè)為miR-142-3p的假定直接靶點(diǎn)(4C)。對(duì)HITS-CLIP數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)展分析顯示,缺氧誘導(dǎo)因子1 alpha (Hif1a)miR-142-3p的潛在靶點(diǎn)(6A)。通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),證實(shí)了miR-142-3p通過直接結(jié)合的3'-UTR序列來減弱Hif1aIfnγr2表達(dá)的能力(6B)。同時(shí),miR-142缺失的Treg細(xì)胞中Hif1αIFNγR2蛋白水平顯著升高,而CD4+Tconv細(xì)胞中Hif1α表達(dá)保持不變(6C)。但是在缺乏miR-142表達(dá)的Treg細(xì)胞中,沒有觀察到Hif1a mRNA表達(dá)的變化。

6Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠中,降低Hif1a基因劑量可部分恢復(fù)Treg群體的正常大小,并減弱外周血T細(xì)胞的過度激活


7.
Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠中,Hif1a單倍體不足挽救了Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)缺陷

為了確定miR-142-Hif1a軸在Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能中的作用,通過將Foxp3CremiR-142fl/fl小鼠與攜帶條件性Hif1a等位基因(Hif1afl/fl)的小鼠雜交,降低了miR-142缺陷型Treg細(xì)胞中Hif1a基因的劑量,產(chǎn)生的Foxp3CremiR-142fl/flHif1a+/fl小鼠顯示Treg細(xì)胞豐度的部分恢復(fù)(圖6D)。此外,Foxp3CremiR-142fl/flHif1a+/fl小鼠顯示出外圍激活/效應(yīng)CD4+ T細(xì)胞頻率的部分降低(6E6F)。


結(jié)論

miR-142作為Treg細(xì)胞發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和抑制活性的中心調(diào)節(jié)因子,部分通過限制IFNγ的產(chǎn)生和應(yīng)答來介導(dǎo)其在Treg細(xì)胞中的功能。該研究促進(jìn)對(duì)Treg細(xì)胞生物學(xué)的理解,這些新的見解可能為癌癥免疫治療和自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞活性的靶向藥理操作開辟新的途徑。