tRF3008A以AGO依賴的方式使FOXK1失穩(wěn)，從而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

tRNA衍生的片段(tRFs)已被證明在癌癥生物學(xué)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而，tRF對結(jié)直腸癌(CRC)的貢獻(xiàn)仍在很大程度上未知。近日，有研究發(fā)現(xiàn)tRF3008A以AGO依賴的方式使FOXK1失穩(wěn)，從而抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。該研究于2022年1月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.系統(tǒng)性識(shí)別CRC中與癌癥相關(guān)的tRF

根據(jù)3對人類CRC和鄰近非腫瘤組織中的tRF和tiRNA-seq分析，用分層聚類熱圖和火山圖顯示（圖1A和B），條形圖來顯示序列讀取長度分布(圖1C)。研究發(fā)現(xiàn)tRF-5在大腸癌組織和ANT中的表達(dá)最高，并且tRF-3在鄰近非腫瘤組織中的表達(dá)高于在大腸癌組織中的表達(dá)（圖1D和E）。為了驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果，選取差異最大的前3個(gè)tRF (tRF3008A、tRF1001和tRF3001)作為候選tRF，發(fā)現(xiàn)tRF3008A(AS-tDR-000076)表達(dá)差異最顯著，且CRC組織的RT-qPCR證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)(圖1F)。

圖1結(jié)直腸癌中tRF基因的全基因組圖譜

2. tRF3008A在體內(nèi)和體外均能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長

RT-qPCR檢測tRF3008A在FHC細(xì)胞株(胎結(jié)腸細(xì)胞株)和7株人CRC細(xì)胞株中的表達(dá)。在8個(gè)細(xì)胞系中，tRF3008A在FHC細(xì)胞中表達(dá)量最高，在CRC細(xì)胞中，HCT116細(xì)胞表達(dá)量最低，HT29細(xì)胞表達(dá)量最高(圖1G)，綜合功能研究選擇HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞。

CCK8和EdU檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，與陰性對照相比，tRF3008A模擬物的生長顯著減少，而tRF3008A敲除后的生長增加(圖2A 和B)。此外，在HCT116和HT29細(xì)胞系中，tRF3008A相對較高組的凋亡細(xì)胞數(shù)比tRF3008A相對較低組的凋亡細(xì)胞數(shù)更多(圖2C)。此外， tRF3008A沉默顯著改善了HT29細(xì)胞的遷移和侵襲，而tRF3008A模擬物則阻礙了HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲(圖2D)。這些數(shù)據(jù)共同表明過表達(dá)tRF3008A可以延遲CRC細(xì)胞的進(jìn)展。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高tRF3008A組的腫瘤生長明顯受到抑制(圖2E 和 F)。而另外HCT116對照組觀察到肺轉(zhuǎn)移，但HCT116 tRF3008A模擬組的肺轉(zhuǎn)移明顯減少(圖2G)。免疫組化染色檢測Ki67(增殖)，cleaved caspase-3(凋亡)和MMP-9(侵襲)進(jìn)一步證實(shí)了tRF3008A對腫瘤進(jìn)展的抑制作用(圖2H)。

圖2 tRF3008A在體外抑制結(jié)直腸癌生長和遷移

3. tRF3008A通過靶向抑制Wnt/β - catenin信號(hào)FOXK1

為了選擇和識(shí)別tRF3008A的下游靶點(diǎn)，采用mRNA靶點(diǎn)預(yù)測算法進(jìn)行生物信息學(xué)分析(圖3A)，發(fā)現(xiàn)重疊程度最高的相關(guān)基因?yàn)锳DAMTS4、DDA1、HOXC13和FOXK1。檢測了這些基因在HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中的表達(dá)水平：ADAMTS4和FOXK1在tRF3008A-Low HCT116細(xì)胞和tRF3008A-High HT29細(xì)胞中的表達(dá)差異最顯著(圖3B)。相關(guān)性結(jié)果顯示FOXK1在CRC中與tRF3008A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而ADAMTS4與tRF3008A表達(dá)呈顯著相關(guān)性，但相關(guān)性較差(圖3C)。為了，通過雙熒光素證實(shí)tRF3008A與預(yù)測靶基因之間的直接關(guān)系載體中(圖3D和E)。與對照組相比，tRF3008A模擬物降低了Luc-FOXK1熒光素酶報(bào)告酶活性，但沒有降低Luc-ADAMTS4的熒光素酶報(bào)告酶活性(圖3E，左)。驗(yàn)證了tRF3008A通過調(diào)控FOXK1的作用3'UTR但不是ADAMTS4。結(jié)合位點(diǎn)突變，使tRF3008A-FOXK1失效3'UTR相互作用，發(fā)現(xiàn)tRF3008A選擇性抑制了FOXK1的WT-3'UTR驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因(圖3E)。進(jìn)一步tRF3008A模擬物降低了FOXK1的蛋白水平，在HCT116細(xì)胞中，tRF3008-LNA的作用增加了HT29細(xì)胞中FOXK1的水平 (圖3)。根據(jù)之前的報(bào)道，F(xiàn)OXK1正向調(diào)控Wnt/β- catenin信號(hào)通路。由于Wnt/β- catenin信號(hào)通路中的下游靶點(diǎn)（c-JUN、c-Myc、cyclin D1、CD44和Axin2）可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長。因此選擇了三個(gè)確定的靶點(diǎn)(C-JUN, c-Myc, cyclin D1)，并發(fā)現(xiàn)在tRF3008A模擬處理下，它們的表達(dá)在HCT116細(xì)胞中顯著下調(diào)，而在HT29細(xì)胞中，在tRF3008A敲除后表達(dá)上調(diào)(圖3G)。

為了測試tRF3008A/FOXK1軸在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，用sh-FOXK1轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它在tRF3008A模擬治療中顯著抑制了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Wnt激動(dòng)劑1減弱了這一作用(S8178)(圖4A)。相反，HT29細(xì)胞中過表達(dá)FOXK1 (OE-FOXK1)誘導(dǎo)的Wnt信號(hào)通路與tRF3008ALNA類似，Wnt通路抑制劑IWR-1-endo可改善Wnt信號(hào)通路(S7086) (圖4A)。HCT116細(xì)胞的生長被sh-FOXK1抑制，凋亡增加，這與tRF3008A模擬處理相似，Wnt激活劑處理降低了HCT116細(xì)胞的生長(圖4B-F)。OE-FOXK1可促進(jìn)HT29細(xì)胞的生長，減少細(xì)胞凋亡，類似于tRF3008A-LNA, Wnt抑制劑可減少細(xì)胞凋亡(圖4B-F)。總的來說，這些觀察結(jié)果表明tRF3008A通過FOXK1/WNT通路至少部分抑制CRC的生長。

圖3 tRF3008A調(diào)控FOXK1表達(dá)

圖4 tRF3008A通過FOXK1/Wnt通路抑制CRC的生長和EMT

4. tRF3008A以一種依賴于AGO的方式使FOXK1失穩(wěn)

通過合成和生物素標(biāo)記的tRF3008A mimic，進(jìn)行了sRAP-MS(小RNA親和純化-質(zhì)譜)來評估tRF3008A相互作用的蛋白。根據(jù)各種結(jié)合評分(圖5A和B)，tRF-3008A被發(fā)現(xiàn)與Argonaute蛋白高度相關(guān)。GO表明，RNA剪接和加工是這些蛋白質(zhì)的共同功能(圖5C)，WB進(jìn)一步證明了tRF3008A與AGO之間的相互作用 (圖5D)。RT-PCR分析證實(shí)tRF3008A在pan-Ago免疫沉淀(IP)部分相對于對照IP富集(圖5E)。此外，tRF3008A特異性地結(jié)合到包含四個(gè)Argonaute蛋白的沉默復(fù)合物中(圖5E)。AGO沉默逆轉(zhuǎn)了tRF3008A誘導(dǎo)的FOXK1在蛋白和mRNA水平上的下調(diào)(圖5F)。因此，AGO對于tRF3008A的基因抑制是必要的。

圖5 tRF3008A依賴于AGO調(diào)節(jié)FOXK1

5. 血清和組織中tRF3008A的低表達(dá)與大腸癌的晚期疾病和轉(zhuǎn)移相關(guān)

表1顯示利用單獨(dú)的訓(xùn)練隊(duì)列(n=45)和驗(yàn)證隊(duì)列(n=34)檢測tRF3008A表達(dá)的潛在臨床意義，低tRF3008A表達(dá)與較大的腫瘤大小和較晚期的臨床分期相關(guān)。tRF3008A高表達(dá)組的DFS較好，而FOXK1高表達(dá)組的DFS較差 (圖6A)。多因素Cox回歸分析顯示，tRF3008A高表達(dá)是兩個(gè)臨床訓(xùn)練隊(duì)列中較好的預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子(HR: 0.701, 95% CI: 0.458 - 1.005, P=0.002，表2)。另外，術(shù)前和術(shù)后患者血液樣本(血漿)中，tRF3008A在術(shù)后表達(dá)增加(圖6B)。同時(shí)，tRF3008A表達(dá)越低，臨床期越早，提示tRF3008A在CRC中起抑癌作用(圖6C)，tRF3008A和FOXK1在CRC組織中呈負(fù)相關(guān) (圖6D)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)支持tRF3008A表達(dá)降低可能是CRC患者預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物。

圖6 tRF3008A作為結(jié)直腸癌的新型預(yù)測性生物標(biāo)志物

結(jié)論：

特定的tRNA衍生片段可能是結(jié)直腸癌發(fā)生的腫瘤抑制調(diào)節(jié)劑：tRNA衍生的tRF3008A，通過與AGO結(jié)合，降低結(jié)腸癌細(xì)胞中致癌轉(zhuǎn)錄本FOXK1的穩(wěn)定性，并在轉(zhuǎn)錄后沉默中發(fā)揮指導(dǎo)作用（圖6E），表明活性的tRF在結(jié)直腸癌中可以作為調(diào)節(jié)因子和潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。