在16q22.1位點的增強子變體通過調(diào)節(jié)PRMT7的表達使其更易發(fā)生肝細胞癌

大多數(shù)癌癥的致病變異是在基因調(diào)控元件中發(fā)現(xiàn)的，例如增強子。然而，易導(dǎo)致肝細胞癌(HCC)的增強子變異仍未被報道。本研究中對HCC增強子進行篩選并研究其分子機制，本研究于2022年4月發(fā)表于《Nature communicate》， IF=12.121。

本文技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1.  增強區(qū)SNP rs73613962與HCC風(fēng)險顯著相關(guān)

為了獲取存在于增強子中的HCC風(fēng)險相關(guān)SNPs，篩選出總計4898個HCC SNPs和7060例非HCC對照，并對其中的6個候選SNPs進行驗證 (Fig. 1a)。在第1個復(fù)制階段，這6個篩選的候選SNPs都被評估為與HCC風(fēng)險的相關(guān)，其中只有rs73613962位于PRMT7的16q22.1位點的內(nèi)含子區(qū)域 (Fig. 1b)。在第2個復(fù)制階段， rs73613962被一致證實與HCC風(fēng)險顯著相關(guān)，rs73613962在GWAS顯著水平上被確定為一個HCC易感位點 (Fig. 1C)。

Fig1 篩選并驗證了候選增強子變體rs73613962與HCC風(fēng)險顯著相關(guān)

2.  含有rs73613962的區(qū)域具有等位基因特異性增強子活性

在HepG2細胞中，rs73613962位點附近的H3K4me1和H3K27ac明顯的表觀遺傳信號驗證了rs73613962位點包含增強子活性的存在(Fig. 2a)。高信號的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和rs73613962附近的DNase簇可能增強了增強子活性(Fig. 2a)。

為了實驗驗證含有rs73613962的增強子活性，作者進行了增強子雙熒光素酶報告基因檢測，發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系中，以rs73613962為中心的DNA序列在正向和反向方向均顯示出高于對照序列的熒光素酶活性 (Fig. 2b–g）。接下來，作者研究了rs73613962是否會影響增強子的活性。結(jié)果表明，在這些HCC細胞系中，具有危險等位基因G的序列與具有非危險等位基因T的序列相比，具有顯著的熒光素酶活性 (Fig. 2b-g)，提示該區(qū)域可能是一個具有等位基因特異性活性的增強子。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明含有HCC易感基因rs73613962的PRMT7內(nèi)含子區(qū)域具有等位基因特異性增強子活性，而rs73613962的風(fēng)險等位基因G相對于非風(fēng)險等位基因T具有更高的增強子活性。

Fig2含有rs73613962的區(qū)域具有增強子信號和等位基因特異性增強子活性

3.  增強子變體rs73613962調(diào)節(jié)PRMT7的表達

為了探究rs73613962是否與其附近基因的表達相關(guān)，肝臟組織進行了cis-eQTL分析，發(fā)現(xiàn)rs73613962僅與PRMT7的表達水平顯著相關(guān) (Fig 3a)。有趣的是，PRMT7是rs73613962的宿主基因，這表明該內(nèi)含子增強子可能直接調(diào)控PRMT7的轉(zhuǎn)錄。此外，rs73613962的風(fēng)險等位基因G被發(fā)現(xiàn)與PRMT7表達增加密切相關(guān)，與上述熒光素酶檢測結(jié)果一致。通過分析rs73613962基因型和rs73613962的表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)所有的肝細胞癌(LIHC)受試者、TCGA腫瘤和癌癥基因中表達模式相同 (Fig 3b）。

為研究包含rs73613962的區(qū)域是否在CRISPR-Cas9， dCAS9-KRAB順式突變、抑制和激活PRMT7表達中起因果作用，利用CRISPR-Cas9對rs73613962周圍區(qū)域進行基因編輯。在CRISPR-Cas9實驗中，作者選擇了rs73613962位點三個不同突變的單克隆和該區(qū)域兩個無突變的克隆進行后續(xù)調(diào)查。如圖3c所示，與兩個對照相比，在三個突變的克隆中，PRMT7的表達量明顯下降，這表明PRMT7的表達受rs73613962的直接調(diào)控（Fig 3C），與此結(jié)果一致的是，CRISPRi檢測結(jié)果顯示，在QGY-7703和HepG2細胞系中，當(dāng)sgRNAs靶向rs73613962的上下游序列時，從QGY-7703和HepG2細胞系中PRMT7的表達均降低，說明包含rs73613962的增強子活性可能減弱， (Fig. 3d–f）。在CRISPRa試驗中，作者檢測到PRMT7 mRNA水平和蛋白水平在QGY-7703和HepG2細胞系中均顯著升高(Fig. 3g–i)。表明該區(qū)域的增強子活性可能通過dCAS9-融合轉(zhuǎn)錄激活域VP48增強。

Fig 3 rs73613962通過調(diào)節(jié)增強子活性來調(diào)節(jié)PRMT7的表達

4.  rs73613962的風(fēng)險等位基因G提高了HNF4A基因的結(jié)合能力

在競爭結(jié)合實驗中觀察到，等位基因G的寡核苷酸對核提取物的競爭能力高于等位基因T的寡核苷酸 (Fig. 4a）。

作者首先通過對含有rs73613962的增強子序列進行ChIP實驗，確定了HNF4A是否能與駐留在rs73613962的增強子結(jié)合。如圖4b所示，當(dāng)HNF4A特異性抗體與對照抗體免疫球蛋白G相比較時，通過ChIP與定量聚合酶鏈反應(yīng)(ChIPqPCR)在QGY-7703細胞株中檢測到HNF4A結(jié)合在該區(qū)域的強富集。此外，ChIP-PCR也證實了HNF4A與QGY-7703和HepG2細胞株中含有rs73613962增強子區(qū)域的結(jié)合(Fig. 4c)。

隨著HNF4A與等位基因G的結(jié)合增多，HNF4A基因的敲除預(yù)計會對含等位基因G的增強子活性產(chǎn)生更大的影響。利用增強子雙熒光素酶報告基因檢測，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)siRNA下調(diào)HNF4A時，含有等位基因G的增強子的熒光素酶活性顯著降低。相比之下，含有等位基因的增強子的熒光素酶活性在HNF4A基因敲除后幾乎沒有變化(Fig. 4d)。此外，在核提取物中加入anti-HNF4A后，兩種肝癌細胞系中HNF4A與含等位基因G的序列的結(jié)合消失了(Fig. 4e)。

由于rs73613962與PRMT7的表達有關(guān)，作者推測，如果rs73613962相關(guān)增強子結(jié)合需要該轉(zhuǎn)錄因子，則下調(diào)該轉(zhuǎn)錄因子將降低靶基因PRMT7的表達。作者在QGY-7703和HepG2細胞系中敲除了HNF4A，并發(fā)現(xiàn)這些細胞中PRMT7的表達下降 (Fig. 4f)。此外，作者發(fā)現(xiàn)PRMT7 RNA水平與HNF4A的表達呈正相關(guān) (Fig. 4g）。有趣的是，攜帶G等位基因的受試者比攜帶TT純合子的受試者具有更高的相關(guān)性 (Fig. 4h，i)。

Fig 4.：rs73613962的風(fēng)險等位基因G增強了轉(zhuǎn)錄因子HNF4A的結(jié)合能力，促進PRMT7的表達

5.  PRMT7促進癌癥相關(guān)表型

作者發(fā)現(xiàn)目的基因PRMT7內(nèi)含子內(nèi)的HCC風(fēng)險等位基因rs73613962 G增強了HNF4A的結(jié)合，而HNF4A反過來促進了PRMT7的表達。因此，作者想知道PRMT7的高表達是否有助于癌癥相關(guān)的細胞表型，從而導(dǎo)致高HCC風(fēng)險。在QGY-7703細胞中，用兩個短發(fā)夾敲低PRMT7 RNAs均降低了QGY-細胞的增殖速率(Fig. 5a，b)。PRMT7-下調(diào)的細胞集落形成能力也低于對照組細胞(Fig. 5c)。此外，細胞耗盡與對照細胞相比，PRMT7表達明顯阻滯G1期，顯著降低S期(Fig. 5d)。此外，在HCC細胞株QGY-7703中，敲除PRMT7可顯著降低細胞遷移和侵襲能力(Fig. 5e，f)。

體內(nèi)致瘤實驗進一步表明，PRMT7下調(diào)可降低異種移植瘤的生長(Fig. 5g–i)。通過免疫組化(IHC)檢測發(fā)現(xiàn)，yu與癌旁組織相比，PRMT7在HCC組織中表達更高 (Fig. 5j，k)。此外，在TCGA LIHC中，腫瘤組織中PRMT7的表達高于正常組織(Fig. 5l)。

綜上所述， PRMT7的表達由含有rs73613962的內(nèi)含子調(diào)控的，可以解釋rs73613962和HCC風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)，至少在一定程度上是這樣的。

Fig 5. PRMT7下調(diào)降低了癌癥相關(guān)表型，而在HCC腫瘤中PRMT7上調(diào)

6.  PRMT7通過H4R3me2s修飾調(diào)節(jié)p53信號通路

對差異表達基因進行功能富集分析，作者發(fā)現(xiàn)在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用的p53信號通路排在前1位，暗示這些在該通路中富集的基因可能參與了prmt7介導(dǎo)的HCC發(fā)展(Fig 6a，b)。作者通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗證了CDKN1A、GADD45B、FAS、PMAIP1等基因?qū)儆?/span>p53信號通路 (Fig. 6c)。

據(jù)報道，PRMT7介導(dǎo)的組蛋白4的精氨酸上的單甲基精氨酸(MMA)可催化建立抑制性組蛋白標(biāo)記。作者通過Western blot檢測了H4R3me2s修飾對prmt7下調(diào)的細胞和對照組的信號。

作者通過WB檢測了PRMT7下調(diào)細胞和對照組細胞中H4R3me2s修飾的信號。檢測到H4R3me2s信號顯著降低，但與對照組相比，PRMT7耗盡樣品的H4沒有明顯變化 (Fig. 6d),表明PRMT7對H4R3me2s修飾基因的調(diào)控。    CAGCTG基序是H4R3me2s 結(jié)合區(qū)顯著富集的序列，因此，作者掃描這些富集于p53信號通路的核心啟動子基因，以獲取CAGCTG motif的分布。，作者通過RNA-seq數(shù)據(jù)對PRMT7下調(diào)細胞中上調(diào)的4個基因進行了研究，并通過qRT-PCR進行了驗證。如圖6e-h，我們發(fā)現(xiàn)p53信號通路中富集的基因H4R3me2s修飾區(qū)包括CAGCTG基序。

因此，這些結(jié)果綜合提示富集于p53信號通路的基因，其H4R3me2s修飾受PRMT7調(diào)控，可能參與了PRMT7介導(dǎo)的癌癥相關(guān)表型。

Fig. 6在HCC細胞中p53信號通路受PRMT7調(diào)控

在PRMT7的一個內(nèi)含子增強區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個肝癌易感SNP rs73613962，并證實了其在癌癥相關(guān)表型中的因果作用。轉(zhuǎn)錄因子HNF4A被發(fā)現(xiàn)與含有rs73613962的增強子區(qū)域結(jié)合，促進宿主基因PRMT7的表達，最終參與了HCC的發(fā)病機制。這一研究成果可能有助于闡明肝癌的發(fā)病機制，并對肝癌的預(yù)防和治療具有潛在的意義。

參考文獻：
 Shen, T., et al., An enhancer variant at 16q22.1 predisposes to hepatocellular carcinoma via regulating PRMT7 expression. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1232.