環(huán)狀RNA ACTN4通過(guò)招募YBX1啟動(dòng)FZD7轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌進(jìn)展

肝內(nèi)膽管癌（ICC）是一種惡性腫瘤，由于ICC具有高度的侵襲性，且缺乏有效的治療手段，尤其是晚期患者，其預(yù)后極差。環(huán)狀RNA （circRNAs）是一類新型非編碼RNA ，異常表達(dá)的circRNA與癌癥的進(jìn)展有關(guān)，而circRNAs在ICC癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用仍有待確定。目前，有研究旨在鑒定ICC中上調(diào)的circRNA，并闡明其在信號(hào)通路中的功能。該研究發(fā)表在《Journal of Hepatology》，IF：25.083。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CircACTN4在ICC組織中上調(diào)

通過(guò)組織芯片發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，ICC組織中有17個(gè)CircRNA顯著上調(diào)（圖1A-B），且circACTN4表達(dá)量最高。qRT-PCR證實(shí)CircACTN4在ICC組織中過(guò)表達(dá)，以及對(duì)RNase R治療的耐藥性（圖1C, D）。qRT-PCR檢測(cè)circACTN4在四種細(xì)胞系中的表達(dá)，之后分別在RBE和FRH0201細(xì)胞系中探究了circACTN4的過(guò)表達(dá)和沉默（圖1E）。使用熒光原位雜交和亞細(xì)胞分離試驗(yàn)，在RBE和FRH0201細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中觀察到circACTN4轉(zhuǎn)錄本（圖1F,G）。與circACTN4低表達(dá)相比，ICC中circACTN4高表達(dá)與較差的3年總生存率和較高的復(fù)發(fā)率相關(guān) （圖1H, I）。

圖1 CircACTN4的鑒定及其與ICC預(yù)后的關(guān)系

2. CircACTN4在體外和體內(nèi)促進(jìn)ICC細(xì)胞的增殖和侵襲

過(guò)表達(dá)circACTN4促進(jìn)RBE細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且促進(jìn)血管生成，而在FRH0201細(xì)胞中干擾circACTN4，抑制其惡性活動(dòng)（圖2A-C）。在異種移植模型中，干擾circACTN4抑制肺轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)circACTN4促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)（圖2D-G）。

圖2 CircACTN4在體外和體內(nèi)促進(jìn)ICC的增殖、遷移和侵襲

3. CircACTN4調(diào)控ICC細(xì)胞中FZD7的表達(dá)

RNA測(cè)序鑒定出過(guò)表達(dá)circACTN4的RBE細(xì)胞中有103個(gè)差異表達(dá)基因 （圖3A, B）。 qRT-PCR證實(shí)了Hippo/Wnt-related genes這些基因在過(guò)表達(dá)circACTN4的RBE細(xì)胞中過(guò)表達(dá)（圖3C, D）。Western blot顯示FZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也隨著circACTN4過(guò)表達(dá)或敲低而改變（圖3E）。由于Wnt/b-catenin通路的受體FZD7在Hippo和Wnt通路中均高于ICC細(xì)胞中的circACTN4過(guò)度表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了FZD7在ICC組織中的表達(dá)水平明顯高于非腫瘤組織（圖3F）。這些結(jié)果通過(guò)組織樣本的qRT-PCR和IHC進(jìn)一步證實(shí)（圖3G，H）。此外，在20個(gè)ICC組織中，circACTN4的表達(dá)與FZD7的表達(dá)呈正相關(guān)（圖3I）。ChIRP分析顯示circACTN4富集在FZD7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）1200到800 bp的區(qū)域（圖3J）。同時(shí)circACTN4沉默后，H3K27Ac組蛋白活性修飾在同一位點(diǎn)的富集度降低，但circACTN4過(guò)度表達(dá)后增加（圖3K，L）。這些結(jié)果表明circACTN4可以結(jié)合FZD7啟動(dòng)子并觸發(fā)FZD7表達(dá)。

圖3 CircACTN4上調(diào)ICC細(xì)胞中FZD7的表達(dá)

4. CircACTN4與YBX1相互作用

RNA-pull down和western blotting結(jié)果顯示，生物素標(biāo)記的circACTN4探針可以在FRH0201細(xì)胞裂解液中沉淀內(nèi)源性YBX1（圖4A），這進(jìn)一步被RIP和RNA EMSA證實(shí)（圖4B, C）。這些結(jié)果表明，circACTN4和YBX1之間存在相互作用。circACTN4的表達(dá)與YBX1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖4D）。此外，TCGA數(shù)據(jù)顯示，YBX1在ICC組織中的表達(dá)明顯高于非腫瘤組織（圖4E），這在ICC組織樣本中通過(guò)qRT-PCR和IHC驗(yàn)證 （圖4F）。此外，circACTN4在RBE細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和在FRH0201細(xì)胞中敲除均不影響YBX1 mRNA的表達(dá)（圖4G）。這些結(jié)果提示circACTN4與YBX1相互作用，并在ICC進(jìn)展過(guò)程中啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄。

圖4 CircACTN4與YBX1相互作用

5. CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的轉(zhuǎn)錄

ChIP-seq分析表明，FRH0201細(xì)胞中的YBX1結(jié)合區(qū)廣泛分布于基因組中，其中24.88%是啟動(dòng)子（圖5A，B）。YBX1結(jié)合區(qū)的基序分析顯示它們的結(jié)合序列偏好不同（圖5C）。通過(guò)重疊RNA-seq和ChIP-seq的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FZD7是ICC細(xì)胞中circACTN4和YBX1的靶點(diǎn)（圖5D）。ChIP-qPCR顯示，YBX1與FZD7啟動(dòng)子富集在同一位點(diǎn)（-400bp~-1600bp）（圖5E）。此外，YBX1基因敲除抑制了H3K27Ac修飾在FRH0201細(xì)胞FZD7啟動(dòng)子上的富集（圖5F）。為了進(jìn)一步證實(shí)circACTN4和YBX1共同調(diào)控FZD7的轉(zhuǎn)錄，敲除circACTN4，發(fā)現(xiàn)FZD7啟動(dòng)子上YBX1的富集程度減少（圖5G）。FZD7 mRNA和蛋白水平的變化也與YBX1過(guò)表達(dá)和敲低一致（圖5H）。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，YBX1的恢復(fù)可以挽救FZD7敲低介導(dǎo)的FRH0201細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移的抑制（圖5I-L）。這些結(jié)果提示circACTN4可能是YBX1介導(dǎo)的FZD7在ICC細(xì)胞中表達(dá)所必需的。

圖5 CircACTN4招募YBX1共激活FZD7轉(zhuǎn)錄

6. CircACTN4通過(guò)吸附miR- 424-5p上調(diào)YAP1的表達(dá)

Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，circACTN4可作為幾種miRNA的海綿。通過(guò)重疊Starbase和Circbase的miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果，12個(gè)候選miRNA被預(yù)測(cè)為circACTN4和YAP1的靶標(biāo)（圖6A）。此外，在轉(zhuǎn)染si-circACTN4的FRH0201細(xì)胞中，只有miR-424-5p表達(dá)上調(diào)（圖6B），而在RNA-RIP實(shí)驗(yàn)中，circACTN4可以直接與miR- 424-5p結(jié)合（圖6C）。轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimic可導(dǎo)致RBE細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降（圖6D, E）。此外，在轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimic的RBE細(xì)胞中，YAP1 mRNA和蛋白水平顯著降低，而miR-424-5p inhibitor的結(jié)果相反（圖6F）。這些結(jié)果表明，circACTN4通過(guò)海綿作用miR- 424-5p調(diào)節(jié)YAP1的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimic和野生型熒光素酶報(bào)告基因的HEK-293 T細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（圖6G）。RIP實(shí)驗(yàn)還顯示，與IgG組相比，argonaute 2組circACTN4和miR-424-5p的富集增加（圖6H）。這些結(jié)果提示circACTN4可作為miR-424- 5p的海綿在ICC細(xì)胞中上調(diào)YAP1。

圖6 CircACTN4通過(guò)海綿吸波miR-424-5p上調(diào)YAP1的表達(dá)

7. CircACTN4參與Wnt/Hippo信號(hào)通路

由于FZD7是Wnt信號(hào)通路受體，推測(cè)circACTN4可能通過(guò)促進(jìn)FZD7轉(zhuǎn)錄參與了該通路的調(diào)控。B-catenin和p-GSK3b表達(dá)的變化與circACTN4過(guò)表達(dá)或敲低表達(dá)一致（圖7A）。在過(guò)表達(dá)circACTN4的RBE細(xì)胞中，b-catenin的核定位顯著增加，而在表達(dá)circACTN4的FRH0201細(xì)胞中，b-catenin的核定位降低（圖7B）。TOP/FOP - flash報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，Wnt/b-catenin通路活性分別根據(jù)circACTN4過(guò)表達(dá)或敲低而顯著增加或降低（圖7C）。免疫熒光檢測(cè)了circACTN4對(duì)b-catenin和YAP1蛋白細(xì)胞定位的影響（圖7D）。結(jié)果表明，YAP1和b-catenin共定位于circACTN4過(guò)表達(dá)的RBE細(xì)胞中，circACTN4促進(jìn)了YAP1和b-catenin的核積累。免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)了YAP1與b-catenin之間的相互作用增強(qiáng)（圖7E）。這些結(jié)果表明，circACTN4增強(qiáng)了YAP1和b-catenin、Hippo和Wnt通路的相互作用，促進(jìn)了它們?cè)?/span>ICC中的激活。

圖7 CircACTN4參與Wnt/Hippo信號(hào)通路

結(jié)論：

ICC中circACTN4的高表達(dá)通過(guò)招募YBX1啟動(dòng)FZD7轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。此外，circACTN4作為miR-424-5p的分子海綿，上調(diào)YAP1的表達(dá)。此外，circACTN4在ICC腫瘤發(fā)生過(guò)程中充當(dāng)Hippo/YAP和Wnt/b-catenin通路之間的交叉點(diǎn)。該研究有助于更好地理解ICC腫瘤的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription