環(huán)狀RNA ACTN4通過招募YBX1啟動FZD7轉錄,促進肝內膽管癌進展

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-04-27
目前,有研究旨在鑒定ICC中上調的circRNA,并闡明其在信號通路中的功能......



肝內膽管癌(ICC)是一種惡性腫瘤,由于ICC具有高度的侵襲性,且缺乏有效的治療手段,尤其是晚期患者,其預后極差。環(huán)狀RNA circRNAs)是一類新型非編碼RNA ,異常表達的circRNA與癌癥的進展有關,而circRNAsICC癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用仍有待確定。目前,有研究旨在鑒定ICC中上調的circRNA,并闡明其在信號通路中的功能。該研究發(fā)表在《Journal of Hepatology》,IF25.083


技術路線:


主要研究結果:

1. CircACTN4ICC組織中上調

通過組織芯片發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,ICC組織中有17CircRNA顯著上調(圖1A-B),且circACTN4表達量最高。qRT-PCR證實CircACTN4ICC組織中過表達,以及對RNase R治療的耐藥性(圖1C, D)。qRT-PCR檢測circACTN4在四種細胞系中的表達,之后分別在RBEFRH0201細胞系中探究了circACTN4的過表達和沉默(圖1E)。使用熒光原位雜交和亞細胞分離試驗,在RBEFRH0201細胞的細胞核和細胞質中觀察到circACTN4轉錄本(圖1F,G)。與circACTN4低表達相比,ICCcircACTN4高表達與較差的3年總生存率和較高的復發(fā)率相關 (圖1H, I)。

1 CircACTN4的鑒定及其與ICC預后的關系


2. CircACTN4
在體外和體內促進ICC細胞的增殖和侵襲

過表達circACTN4促進RBE細胞的增殖、遷移和侵襲,并且促進血管生成,而在FRH0201細胞中干擾circACTN4,抑制其惡性活動(圖2A-C)。在異種移植模型中,干擾circACTN4抑制肺轉移和腫瘤生長,而過表達circACTN4促進肺轉移和腫瘤生長(圖2D-G)。

2 CircACTN4在體外和體內促進ICC的增殖、遷移和侵襲


3. CircACTN4
調控ICC細胞中FZD7的表達

RNA測序鑒定出過表達circACTN4RBE細胞中有103個差異表達基因 (圖3A, B)。 qRT-PCR證實了Hippo/Wnt-related genes這些基因在過表達circACTN4RBE細胞中過表達(圖3C, D)。Western blot顯示FZD7、ID2CCN2AXIN2的蛋白水平也隨著circACTN4過表達或敲低而改變(圖3E)。由于Wnt/b-catenin通路的受體FZD7HippoWnt通路中均高于ICC細胞中的circACTN4過度表達。TCGA數(shù)據(jù)庫揭示了FZD7ICC組織中的表達水平明顯高于非腫瘤組織(圖3F)。這些結果通過組織樣本的qRT-PCRIHC進一步證實(圖3G,H)。此外,在20ICC組織中,circACTN4的表達與FZD7的表達呈正相關(圖3I)。ChIRP分析顯示circACTN4富集在FZD7啟動子轉錄起始位點(TSS1200800 bp的區(qū)域(圖3J)。同時circACTN4沉默后,H3K27Ac組蛋白活性修飾在同一位點的富集度降低,但circACTN4過度表達后增加(圖3K,L)。這些結果表明circACTN4可以結合FZD7啟動子并觸發(fā)FZD7表達。

3 CircACTN4上調ICC細胞中FZD7的表達


4. CircACTN4
YBX1相互作用

RNA-pull downwestern blotting結果顯示,生物素標記的circACTN4探針可以在FRH0201細胞裂解液中沉淀內源性YBX1(圖4A),這進一步被RIPRNA EMSA證實(圖4B, C)。這些結果表明,circACTN4YBX1之間存在相互作用。circACTN4的表達與YBX1的表達呈正相關(圖4D)。此外,TCGA數(shù)據(jù)顯示,YBX1ICC組織中的表達明顯高于非腫瘤組織(圖4E),這在ICC組織樣本中通過qRT-PCRIHC驗證 (圖4F)。此外,circACTN4RBE細胞中過表達和在FRH0201細胞中敲除均不影響YBX1 mRNA的表達(圖4G)。這些結果提示circACTN4YBX1相互作用,并在ICC進展過程中啟動下游基因轉錄。

4 CircACTN4YBX1相互作用


5. CircACTN4
招募YBX1共同激活FZD7的轉錄

ChIP-seq分析表明,FRH0201細胞中的YBX1結合區(qū)廣泛分布于基因組中,其中24.88%是啟動子(圖5A,B)。YBX1結合區(qū)的基序分析顯示它們的結合序列偏好不同(圖5C)。通過重疊RNA-seqChIP-seq的結果,發(fā)現(xiàn)FZD7ICC細胞中circACTN4YBX1的靶點(圖5D)。ChIP-qPCR顯示,YBX1FZD7啟動子富集在同一位點(-400bp~-1600bp)(圖5E)。此外,YBX1基因敲除抑制了H3K27Ac修飾在FRH0201細胞FZD7啟動子上的富集(圖5F)。為了進一步證實circACTN4YBX1共同調控FZD7的轉錄,敲除circACTN4,發(fā)現(xiàn)FZD7啟動子上YBX1的富集程度減少(圖5G)。FZD7 mRNA和蛋白水平的變化也與YBX1過表達和敲低一致(圖5H)。細胞功能實驗表明,YBX1的恢復可以挽救FZD7敲低介導的FRH0201細胞生長、血管生成和轉移的抑制(圖5I-L)。這些結果提示circACTN4可能是YBX1介導的FZD7ICC細胞中表達所必需的。

5 CircACTN4招募YBX1共激活FZD7轉錄


6. CircACTN4
通過吸附miR- 424-5p上調YAP1的表達

Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫預測,circACTN4可作為幾種miRNA的海綿。通過重疊StarbaseCircbasemiRNA靶標預測結果,12個候選miRNA被預測為circACTN4YAP1的靶標(圖6A)。此外,在轉染si-circACTN4FRH0201細胞中,只有miR-424-5p表達上調(圖6B),而在RNA-RIP實驗中,circACTN4可以直接與miR- 424-5p結合(圖6C)。轉染miR-424-5p mimic可導致RBE細胞增殖、遷移和侵襲能力下降(圖6D, E)。此外,在轉染miR-424-5p mimicRBE細胞中,YAP1 mRNA和蛋白水平顯著降低,而miR-424-5p inhibitor的結果相反(圖6F)。這些結果表明,circACTN4通過海綿作用miR- 424-5p調節(jié)YAP1的表達。熒光素酶報告基因檢測顯示,與對照組相比,共轉染miR-424-5p mimic和野生型熒光素酶報告基因的HEK-293 T細胞的熒光素酶活性顯著降低(圖6G)。RIP實驗還顯示,與IgG組相比,argonaute 2circACTN4miR-424-5p的富集增加(圖6H)。這些結果提示circACTN4可作為miR-424- 5p的海綿在ICC細胞中上調YAP1。

6 CircACTN4通過海綿吸波miR-424-5p上調YAP1的表達


7. CircACTN4
參與Wnt/Hippo信號通路

由于FZD7Wnt信號通路受體,推測circACTN4可能通過促進FZD7轉錄參與了該通路的調控。B-cateninp-GSK3b表達的變化與circACTN4過表達或敲低表達一致(圖7A)。在過表達circACTN4RBE細胞中,b-catenin的核定位顯著增加,而在表達circACTN4FRH0201細胞中,b-catenin的核定位降低(圖7B)。TOP/FOP - flash報告實驗顯示,Wnt/b-catenin通路活性分別根據(jù)circACTN4過表達或敲低而顯著增加或降低(圖7C)。免疫熒光檢測了circACTN4b-cateninYAP1蛋白細胞定位的影響(圖7D)。結果表明,YAP1b-catenin共定位于circACTN4過表達的RBE細胞中,circACTN4促進了YAP1b-catenin的核積累。免疫共沉淀進一步證實了YAP1b-catenin之間的相互作用增強(圖7E)。這些結果表明,circACTN4增強了YAP1b-catenin、HippoWnt通路的相互作用,促進了它們在ICC中的激活。

7 CircACTN4參與Wnt/Hippo信號通路


結論:

ICCcircACTN4的高表達通過招募YBX1啟動FZD7轉錄促進腫瘤的發(fā)展和進展。此外,circACTN4作為miR-424-5p的分子海綿,上調YAP1的表達。此外,circACTN4ICC腫瘤發(fā)生過程中充當Hippo/YAPWnt/b-catenin通路之間的交叉點。該研究有助于更好地理解ICC腫瘤的發(fā)生。

 

參考文獻:

Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription