CircVPS13C促進(jìn)垂體腺瘤的生長(zhǎng)

垂體腺瘤（NFPA）是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一。CircRNA通過充當(dāng)miRNA海綿和蛋白質(zhì)支架或編碼功能性蛋白質(zhì)在多種生物過程中發(fā)揮重要作用。然而，circRNA在NFPA進(jìn)展中的作用尚不清楚。在本文中，CircVPS13C在NFPA樣本和細(xì)胞系中顯著上調(diào)。功能獲得和功能喪失實(shí)驗(yàn)表明，在體外和體內(nèi)，沉默circVPS13C抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖。在機(jī)制上，circVPS13C沉默增加IFITM1的表達(dá)，并隨后激活其參與MAPK和凋亡相關(guān)信號(hào)通路的下游基因。拯救實(shí)驗(yàn)表明IFITM1的過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了circVPS13C的生物學(xué)效應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，circVPS13C通過與RRBP1競(jìng)爭(zhēng)性相互作用抑制IFITM1的表達(dá)，從而減輕IFITM1 mRNA的穩(wěn)定性。臨床上，高風(fēng)險(xiǎn)NFPA樣本中circVPS13C的表達(dá)明顯較高，經(jīng)蝶竇腺瘤切除術(shù)后7天患者血清中circVPS13C表達(dá)下調(diào)。我們的研究結(jié)果表明，circVPS13C通過一種新的機(jī)制，即通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的核糖體結(jié)合蛋白相互作用來調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性在NFPA的增殖和發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本文于2022年1月發(fā)表于Oncogene（IF=9.867）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）NFPA樣本中circVPS13C表達(dá)顯著增加

使用CircRNA微陣列比較年齡和性別配對(duì)的NFPA和NP組織的CircRNA表達(dá)譜。微陣列強(qiáng)度值的箱線圖顯示樣本之間的差異較小，表明兩組之間的circRNA表達(dá)模式相似（圖1a）。熱圖（圖1b）和火山圖（圖1c）用于顯示兩組中差異表達(dá)的CircRNA。兩組共有1493個(gè)circRNAs差異表達(dá)。其中，在NFPA樣本中，990個(gè)顯著上調(diào)，503個(gè)顯著下調(diào)。我們重點(diǎn)研究了具有較高絕對(duì)表達(dá)水平的上調(diào)circRNA。我們選擇了其中10個(gè)circRNAs進(jìn)行進(jìn)一步研究，因?yàn)閾?jù)報(bào)道它們的親本基因參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。與NP組織相比，NFPA樣本中的所有circRNAs均被證實(shí)顯著上調(diào)（圖1d）。然后，選擇qRT-PCR周期閾值最低的前5個(gè)circRNAs，采用CCK-8法評(píng)價(jià)其在垂體腫瘤衍生濾泡星狀細(xì)胞(PDFS)中的生物學(xué)功能。如圖1e所示，circVPS13C沉默后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果最好。綜上所述，這些結(jié)果促使我們進(jìn)一步研究circVPS13C在NFPA發(fā)生和發(fā)展中的作用。

2）circVPS13C在垂體腺瘤細(xì)胞中的鑒定與驗(yàn)證

CircVPS13C轉(zhuǎn)錄自VPS13C基因位點(diǎn)，位于人類第15號(hào)染色體上。其長(zhǎng)度為608 bp，包含8-13外顯子。為了確認(rèn)circVPS13C是一個(gè)circRNA，我們進(jìn)行了Sanger測(cè)序來識(shí)別頭尾剪接(圖2a)。然后，設(shè)計(jì)不同的引物，以PDFS細(xì)胞中提取的cDNA或gDNA為模板，擴(kuò)增內(nèi)源性circVPS13C的頭尾剪接位點(diǎn)(圖2b)。最后，RNase R耐受試驗(yàn)和瓊脂糖電泳分析證實(shí)circVPS13C對(duì)RNase R耐受(圖2c)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了circVPS13C是一個(gè)真正的circRNA。為了表征circVPS13C的亞細(xì)胞位置，我們用RNA-FISH方法對(duì)circVPS13C進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在PDFS細(xì)胞中，circVPS13C在細(xì)胞質(zhì)和核中都富集。亞細(xì)胞分離分析和半定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了circVPS13C在細(xì)胞質(zhì)和核中的富集(圖2d)。此外，我們用RNA-FISH檢測(cè)了circVPS13C在NFPA和正常垂體樣本中的分布。與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，circVPS13C染色在NFPA樣本中比在正常垂體組織中更集中(圖2e)。

3）CircVPS13C沉默部分通過增加凋亡抑制NFPA細(xì)胞的增殖

為了評(píng)價(jià)circVPS13C在NFPA發(fā)育中的生物學(xué)功能，我們利用PDFS和人源性NFPA原代細(xì)胞進(jìn)行了功能獲得和功能喪失實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，circVPS13C的表達(dá)被兩種shRNAs有效地沉默，在轉(zhuǎn)染circVPS13C載體的PDFS細(xì)胞中穩(wěn)定上調(diào)(圖3a)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，沉默circVPS13C顯著削弱了PDFS細(xì)胞和人源NFPA細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)circVPS13C則有相反的效果(圖3b)。然后，我們進(jìn)一步確定了circVPS13C對(duì)另外6個(gè)人源性NFPA原代細(xì)胞的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，在培養(yǎng)72 h后，circVPS13C沉默均顯著抑制了它們的生長(zhǎng)(圖3c)。同樣，敲低circVPS13C后，PDFS細(xì)胞的集落形成也受到明顯抑制(圖3d)。此外，流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)顯示，在circVPS13C敲低的細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的比例顯著增加，而在過表達(dá)circVPS13C的細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的比例顯著降低(圖3e)。為了進(jìn)一步證明circVPSC13C對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞的作用，我們?cè)u(píng)估了circVPSC13C對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，該通路已被證明在包括垂體腺瘤在內(nèi)的各種腫瘤的細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。一致地，circVPS13C沉默降低了體外Bcl-2、 pERK1/2和p-P38的蛋白水平，增加了cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Bax的蛋白水平。CircVPS13C過表達(dá)產(chǎn)生了相反的效果(圖3f)。最后，為了確定circVPS13C在體內(nèi)是否影響NFPA細(xì)胞的增殖，我們將轉(zhuǎn)染了circVPS13C表達(dá)載體或sh-circVPS13C的PDFS細(xì)胞注射到裸鼠皮下組織。從circVPS13C敲低細(xì)胞中生長(zhǎng)的腫瘤明顯比從對(duì)照細(xì)胞中生長(zhǎng)的腫瘤更小更輕(圖3g)。綜上所述，沉默circVPS13C可以抑制體外和體內(nèi)NFPA細(xì)胞的增殖，部分原因是通過增加凋亡。

4）CircVPS13C沉默部分通過上調(diào)IFITM1表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖

為了研究circVPS13C對(duì)NFPA細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的潛在機(jī)制，我們對(duì)三對(duì)circVPS13C沉默的PDFS細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了mRNA-seq分析。結(jié)果顯示，沉默circVPS13C后，共有429個(gè)基因顯著上調(diào)，19個(gè)基因下調(diào)(圖4a)。在15個(gè)NFPA和8個(gè)NP樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證了表達(dá)增加最多的前10個(gè)基因和表達(dá)減少最多的9個(gè)基因，IFITM1是變化最顯著的基因之一(圖4b)。據(jù)報(bào)道，IFITM1已被廣泛描述參與細(xì)胞增殖和遷移。此外，18個(gè)樣品的western blot和43個(gè)NFPA樣品的qRT-PCR均證實(shí)IFITM1表達(dá)下調(diào)(圖4c)，在43個(gè)NFPA樣本中，circVPS13C和IFITM1顯著負(fù)相關(guān)(圖4d)。qRT-PCR和western blotting分析表明，circVPS13C基因的下調(diào)增加了IFITM1的表達(dá)，而circVPS13C過表達(dá)則產(chǎn)生相反的結(jié)果（圖4e）。為了確定circVPS13C對(duì)NFPA細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)是否通過抑制IFITM1介導(dǎo)，我們進(jìn)行了一項(xiàng)涉及circVPS13C和IFITM1的拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，敲低IFITM1可以部分逆轉(zhuǎn)circVPS13C敲低對(duì)PDFS細(xì)胞增殖和集落形成的抑制作用(圖4f-h)。此外，IFITM1的敲除在一定程度上逆轉(zhuǎn)了circVPS13C沉默對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和MAPK通路中蛋白水平的影響(圖4i)。總的來說，circVPS13C沉默部分通過增強(qiáng)IFITM1的表達(dá)來抑制NFPA細(xì)胞的生長(zhǎng)。

5）circVPS13C通過與RRBP1相互作用降低IFITM1 mRNA的穩(wěn)定性，從而抑制其表達(dá)

我們?cè)噲D研究circVPS13C如何調(diào)節(jié)IFITM1的表達(dá)。我們進(jìn)行了ChIRP分析，以識(shí)別潛在的circVPS13C相關(guān)蛋白，如圖5a所示。ChIRP-qPCR驗(yàn)證，circVPS13C-sense探針在處理組的富集效率比NC組高104倍(圖5b)。應(yīng)用瓊脂糖電泳和銀染色對(duì)circVPS13C RNA相關(guān)蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)anti-circVPS13C探針組與NC探針組有明顯不同的陽(yáng)性信號(hào)。然后采用LC-MS/MS法對(duì)陽(yáng)性樣品中的蛋白進(jìn)行鑒定(圖5c)。在circVPS13C-sense探針組中富含的蛋白中，RRBP1因其在circVPS13C-sense探針組中表達(dá)量高而備受關(guān)注，因?yàn)橐延袌?bào)道稱RRBP1與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。我們用ChIRP-western blot進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖5d)。然后，我們檢測(cè)RRBP1是否參與調(diào)節(jié)IFITM1的表達(dá)。如圖5e所示，RRBP1沉默后IFITM1 mRNA和蛋白水平均顯著降低，而RRBP1過表達(dá)細(xì)胞IFITM1 mRNA和蛋白水平升高。同樣，經(jīng)western blotting證實(shí)，RRBP1過表達(dá)增加了IFITM1的水平，并部分挽救了circVPS13C對(duì)IFITM1表達(dá)的抑制(圖5f)。先前的研究證實(shí)RRBP1是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白，可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，增強(qiáng)mRNA與核糖體的結(jié)合，促進(jìn)翻譯。放線菌素D抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后，在不同時(shí)間提取總RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)IFITM1 mRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，當(dāng)RRBP1沉默或circVPS13C過表達(dá)時(shí)，IFITM1 mRNA的降解顯著加快。過表達(dá)RRBP1部分消除了circVPS13C對(duì)IFITM1 mRNA的影響(圖5g)。綜上所述，circVPS13C可能通過與RRBP1相互作用部分調(diào)控IFITM1的表達(dá)。

6）CircVPS13C通過與RRBP1競(jìng)爭(zhēng)性相互作用抑制IFITM1的表達(dá)

我們探究circVPS13C如何與RRBP1相互作用抑制IFITM1的表達(dá)。circVPS13C表達(dá)的增加和減少并沒有引起RRBP1蛋白水平的顯著變化(圖6a)。同樣，RRBP1和circVPS13C mRNA表達(dá)在NFPA樣本中也沒有顯著相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明circVPS13C不太可能調(diào)控RRBP1的表達(dá)。RIP-qPCR結(jié)果顯示，circVPS13C過表達(dá)增加了circVPS13C與RRBP1的相互作用水平，但降低了IFITM1與RRBP1的相互作用水平，并伴隨著降低IFITM1 mRNA的表達(dá)。CircVPS13C的沉默產(chǎn)生了相反的效果。因此，我們推斷circVPS13C通過與RRBP1競(jìng)爭(zhēng)性相互作用抑制IFITM1的表達(dá)。RIP-qPCR結(jié)果顯示，與RRBP1WT和circVPS13C的互作水平相比，RRBP1T554A + Q551A和circVPS13C的互作水平顯著降低(圖6d)。然后，我們用質(zhì)粒RRBP1T554A + Q551A和RRBP1WT轉(zhuǎn)染PDFS細(xì)胞進(jìn)行共定位檢測(cè)。熒光共定位結(jié)果顯示，circVPS13C和RRBP1WT蛋白共定位于PDFS細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但未檢測(cè)到與RRBP1T554A + Q551的共定位(圖6e)。這些結(jié)果表明RRBP1通過GLN551和THR554殘基與circVPS13C相互作用。RRBP1- circVPS13C復(fù)合物的模擬結(jié)構(gòu)和詳細(xì)的殘基相互作用如圖6f所示。

7）circVPS13C在NFPA中的臨床意義

通過qRT-PCR檢測(cè)93個(gè)NFPAs和23個(gè)年齡和性別配對(duì)的NP組織中circVPS13C的水平。如圖7a所示，與正常組織相比，circVPS13C在NFPA組織中表達(dá)明顯升高，且?guī)缀踉谒?/span>NFPA樣本中circVPS13C表達(dá)均上調(diào)。然而，與正常垂體組織相比，circVPS13C在分泌GH腺瘤和催乳素瘤中表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，而在TSH腺瘤中表達(dá)下調(diào)(圖7b)。接著，我們分析臨床因素對(duì)circVPS13C表達(dá)的影響。circVPS13C在Knosp的IV級(jí)樣本(圖7c)和較大的腫瘤(圖7d)中表達(dá)更高。我們發(fā)現(xiàn)與其他腫瘤相比，circVPS13C在沉默的皮質(zhì)滋養(yǎng)腺瘤中的平均表達(dá)明顯更高(圖7e)。更有趣的是，術(shù)后7天circVPS13C在患者血清中的表達(dá)下調(diào)(圖7f)。此外，血清circVPS13C水平與腫瘤樣本中的circVPS13C水平相關(guān)，并與腫瘤直徑顯著相關(guān)(圖7g)。同時(shí)，上清circVPS13C水平與PDFS細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及培養(yǎng)時(shí)間顯著相關(guān)(圖7h)。綜上所述，circVPS13C特異性地結(jié)合并隔離RRBP1，通過促進(jìn)IFITM1 mRNA的降解降低IFITM1的表達(dá)，從而最終促進(jìn)NFPA的增殖(圖7i)。

結(jié)論：
   CircVPS13C在NFPA樣本中顯著上調(diào)，并與NFPA的侵襲性特征相關(guān)。通過與RRBP1的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用，circVPS13C的沉默降低了IFITM1 mRNA的穩(wěn)定性，從而抑制了NFPA細(xì)胞的生長(zhǎng)。CircVPS13C是NFPA增殖和發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，提示其可能成為NFPA管理的診斷因子和治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Zhang W, Chen S, Du Q, Bian P, Chen Y, Liu Z, Zheng J, Sai K, Mou Y, Chen Z, Fan X, Jiang X. CircVPS13C promotes pituitary adenoma growth by decreasing the stability of IFITM1 mRNA via interacting with RRBP1. Oncogene. 2022 Mar;41(11):1550-1562. doi: 10.1038/s41388-022-02186-0.