PUMILIO蛋白通過抑制p21促進結(jié)直腸癌的生長
PUMILIO (PUM)蛋白屬于高度保守的PUF家族轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白，參與多種生物過程。然而，它們在癌變中的作用仍有待探索。在這里，作者報道了Pum1和Pum2在人類結(jié)直腸癌(CRC)中表達增加。本文于2022年3月發(fā)表于《nature communications》,IF=12.121。
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本文主要內(nèi)容：
1 PUM1和PUM2在人類CRC中表達增加, 腸道特異性缺失Pum1和Pum2抑制AOM/dss誘導(dǎo)的體內(nèi)結(jié)腸癌發(fā)生
為了進一步將Pum1和Pum2與CRC的關(guān)系，作者對22名患者的CRC樣本及其鄰近組織的mRNA表達進行了兩兩比較。作者發(fā)現(xiàn)Pum1和Pum2在CRC臨床標(biāo)本中高表達(Fig 1a, c)。其中，15例患者的Pum1 mRNA水平和13例患者的Pum2 mRNA水平至少比其配對的相鄰正常組織高10倍。此外,TCGA數(shù)據(jù)集顯示Pum1而不是Pum2的表達與CRC分期呈正相關(guān) (Fig. 1b, d)。
為了研究PUM蛋白在結(jié)直腸癌中的作用，作者建立了一個小鼠模型，通過條件敲除腸道上皮組織中的Pum1和Pum2基因，評價PUM蛋白在結(jié)直腸癌中的作用(Fig. 1e)。將Lgr5-cre小鼠與Pum1flox/flox::Pum2flox/flox小鼠雜交產(chǎn)生Lgr5cre::Pum1flox/flox::Pum2flox/flox小鼠。用他莫西芬處理Lgr5cre::Pum1flox/flox::Pum2flox/flox小鼠，獲得結(jié)腸上皮細胞Pum1和Pum2雙敲除小鼠(Pum1/ 2cko)。Tamoxifen處理的Pum1flox / flox:: Pum2flox/flox小鼠作為對照組。免疫組化分析顯示，Pum1/2CKO老鼠結(jié)腸中無明顯PUM1和PUM2蛋白存在(Fig 1j)。AOM/DSS治療后，與對照組相比，Pum1/2CKO小鼠腸道內(nèi)腫瘤數(shù)量和大小明顯減少(Fig 1f)。定量分析發(fā)現(xiàn)，Pum1/2CKO小鼠大腫瘤(直徑>4mm)數(shù)量顯著減少91.5%，中型腫瘤(直徑2 - 4mm)數(shù)量顯著減少和小(< 2mm)腫瘤也分別減少了59.4%和25.9%(Fig. 1g)。有趣的是, 盡管Pum1/2KO小鼠比野生型對照組小，Pum1 /2CKO小鼠結(jié)腸更長，體重更重(Fig 1h, i)。這表明，對照組小鼠更容易患腫瘤，因為在沒有誘導(dǎo)的小鼠中，結(jié)腸長度的縮短是炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)，而炎癥是結(jié)腸致癌的潛在原因。此外，在Pum1/2CKO小鼠中，表現(xiàn)為高度不典型增生的腺瘤明顯減少(Fig. 1k)。提示Pum1/2CKO腸內(nèi)惡性進展受到抑制。Ki-67和TUNEL染色顯示，Pum1/2CKO顯著降低腫瘤細胞增殖，但對細胞凋亡無顯著影響(Fig. 1l, m)。綜上所述，這些結(jié)果表明Pum1/2缺失顯著抑制CRC的起始和發(fā)展。
Fig1 Pum1/2CKO抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展
2. PUM蛋白有助于CRC細胞的體外生長和體內(nèi)致瘤性
進一步研究PUM1和PUM2 在CRC中的功能，首先檢測了6個不同的CRC細胞株中Pum1和Pum2的表達，以正常人類結(jié)腸黏膜上皮細胞NCM460作為對照(Fig 2a, b)。結(jié)果顯示，6個CRC細胞株中Pum1的表達量均顯著高于正常細胞株，HCT116細胞中蛋白質(zhì)的表達水平最高。Pum2在6個癌細胞株中也有5個表現(xiàn)出異常高的表達水平，盡管過表達程度一般沒有Pum1大。WB證實了PUM1和PUM2的細胞質(zhì)缺失(Fig. 2c)。此外，作者通過篩選400多個單細胞克隆，篩選Pum1/2雙敲除的HCT116細胞，但未能恢復(fù)任何雙敲除細胞。這一結(jié)果提示Pum1/2雙敲除可能嚴(yán)重損害HCT116細胞的生存。
分別敲除Pum1 (Pum1?/?)和Pum2發(fā)現(xiàn)Pum1和Pum2的缺失顯著抑制了HCT116和RKO細胞的集落形成和增殖(Fig. 2d–i)。一致地，Pum1缺乏導(dǎo)致HCT116和RKO細胞G1/S過渡的延遲(Fig. 2j, k)。在異種移植實驗中，敲除Pum1能顯著抑制小鼠HCT116和RKO細胞的致瘤性(Fig. 2l–q)。Pum2?/?克隆顯示類似的表型，但在HCT116細胞中不那么嚴(yán)重(Fig. 2d–q)?？傊?，這些結(jié)果表明Pum1和Pum2在體內(nèi)和體外細胞生長中都對CRC的致瘤性至關(guān)重要。
Fig2 PUM1和PUM2促進結(jié)直腸癌細胞的體外生長和體內(nèi)致瘤性
3. PUM1通過直接調(diào)控癌相關(guān)基因和細胞周期相關(guān)基因
為了探索PUM在CRC中的作用的分子機制，作者通過深度測序分析了Pum1?/?和Pum2?/?HCT116細胞的轉(zhuǎn)錄組(Fig. 3a, b)，作者在Pum1和Pum2敲除細胞中分別鑒定出1132個和1226個差異表達基因。在Pum1?/?細胞,740個基因mRNA水平升高，392個基因mRNA水平降低。其中，Cdkn1a/p21、Cdkn2d、Cdkn2c等細胞周期抑制基因表達上調(diào)(Fig. 3a)。此外，Ccnd3、Tgfb1在Pum2?/?細胞中上，調(diào)但在Pum1?/?細胞中未見明顯上調(diào)(Fig. 3b)。
由于PUM蛋白主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶標(biāo)，作者預(yù)計其靶標(biāo)在蛋白質(zhì)水平也會發(fā)生變化。因此，作者使用TMT標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來識別野生型、Pum1?/?和Pum2?/?HCT116細胞之間的蛋白質(zhì)變化(Fig. 3c, d)。在Pum1?/?HCT116細胞中，細胞周期抑制基因Cdkn1a/p21的mRNA和蛋白水平上調(diào)。這表明在CRC中，PUM1可能抑制p21的翻譯。在Pum2?/?HCT116細胞中，Wnt信號抑制劑Dkk1和腫瘤抑制基因Susd2和Pdlim5的蛋白水平也上調(diào)，表明Wnt通路的參與。Pum1和Pum2敲除后基因表達在mRNA和蛋白水平上的變化相關(guān)性為0.695((Fig. 3e，f)。這說明蛋白質(zhì)水平的變化在很大程度上是由mRNA水平的變化引起的。此外，Pum1?/?和Pum2?/?細胞的基因表達變化相當(dāng)相似，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上相關(guān)性為0.782和0.708（Fig. 3g，h）?？偟膩碚f，Pum1敲除的mRNA豐度變化略大于Pum2敲除。平均而言， Pum1?/?細胞比Pum2?/?細胞顯示出更大程度的折疊變化(Fig. 3i–l），與Pum1?/?和的致瘤性缺陷一致在Pum2?/?HCT116細胞中，PUM蛋白可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達來促進結(jié)直腸癌的生長。
Fig3癌癥相關(guān)基因在Pum1?/?HCT116細胞受影響的基因中富集
分析發(fā)現(xiàn)2228和1961簇是兩個野生型的PUM1結(jié)合位點，這些簇顯示出PUM1結(jié)合轉(zhuǎn)錄本有很大重疊（Fig. 4a）。而結(jié)合位點顯示了保守的TGTANATA結(jié)合基序(Fig. 4b)。該motif主要存在于mRNA的3' UTR中，第二個豐富的區(qū)域是CDS (Fig. 4c)。PAR-CLIP識別的靶點用qPCR進行驗證（Fig. 4d,e）?？紤]到在Pum1-缺陷細胞中觀察到的G1/S過渡延遲，作者主要關(guān)注與G1進程有關(guān)的基因，并發(fā)現(xiàn)在Pum1-/- HCT116，p21/Cdkn1a細胞中上調(diào)的基因在PUM1 PAR-CLIP中富集 (Fig. 4f)。此外，細胞周期和腫瘤通路如ErbB信號通路、p53信號通路和CRC通路也在Pum1的直接靶點中富集(Fig. 4g）。
分析了1968個在Pum1?/?HCT116細胞中表達發(fā)生變化的蛋白。其中15個mRNA和48個蛋白被鑒定為PUM1的靶點(Fig. 4h–k)。對其進行KEGG分析，結(jié)果顯示它們在細胞周期和癌癥通路等中富集(Fig. 4l, m）。RT-qPCR檢測Pum1?/?HCT116細胞中17個mRNA的變化。這些結(jié)果表明PUM1是CRC細胞生長所必需的，主要是通過直接調(diào)控與癌癥相關(guān)和細胞周期相關(guān)的基因。
Fig4 PAR-CLIP-seq鑒定PUM1的靶基因
5. PUM1直接抑制p21調(diào)節(jié)CRC的生長
RNA深度測序和蛋白質(zhì)譜分析顯示，p21在RNA和蛋白水平上都受到PUM1的抑制。作者通過RT-Qpcr和WB進一步證實了這一結(jié)果，在Pum1?/?細胞中，p21的RNA和蛋白水平升高(Fig. 5a, b)。然而，Pum2?/?中p21 RNA和蛋白質(zhì)水平的增加，沒有在Pum1?/?細胞中顯著表達(在轉(zhuǎn)染siPum1和/或siPum2的HCT116細胞中觀察到類似的現(xiàn)象，數(shù)據(jù)未顯示)，與此一致，RIP實驗表明，p21 mRNA與PUM1結(jié)合較強(富集7.4倍)，而與PUM2結(jié)合較弱(富集1.9倍) (Fig 5c, d)。因此，作者專注于對p21的PUM1調(diào)控。
為了檢測PUM1是否負向調(diào)控p21 mRNA的穩(wěn)定性，作者用放線菌素抑制轉(zhuǎn)錄，然后檢測HCT116細胞的mRNA水平(Fig. 5e)。發(fā)現(xiàn)p21 mRNA的穩(wěn)定性在Pum1?/?HCT116細胞中增加，但在Pum2?/?HCT116細胞中不顯著。這些結(jié)果表明，PUM1通過負向調(diào)控p21 mRNA的穩(wěn)定性來抑制p21，而PUM2對p21 mRNA的穩(wěn)定性影響不大。
考慮到PUM1對p21的抑制以及p21可能參與CRC，作者研究了PUM1的缺失是否會通過直接上調(diào)p21的表達來減少細胞增殖并延遲G1-S的轉(zhuǎn)移。作者通過敲入HCT116細胞基因組中一個突變的PRE供體序列，使p21基因中的PRE發(fā)生突變(Fig. 5f)。DNA測序結(jié)果顯示p21 PRE的生成(Fig. 5g)。如預(yù)期的那樣，p21 PRE突變減少了PUM1與p21 mRNA的結(jié)合(Fig. 5h), 導(dǎo)致p21 mRNA和蛋白表達增加(Fig. 5i, j)。這些結(jié)果表明，p21 PREmut/mut可以抑制PUM1對p21mRNA的抑制。接下來作者分析了p21 PREmut/mut細胞的細胞生長和細胞周期。與預(yù)期一樣，p21 PREmut/mut細胞的集落形成減少，細胞增殖減少(Fig. 5k–n)，G0/G1期細胞比例增加(Fig. 5o)。這些結(jié)果表明，p21 mRNA是PUM1促進CRC細胞生長的直接和主要靶點。
Fig5 PUM1通過直接抑制p21調(diào)控CRC的生長
6. 納米顆粒包裹的PUM siRNA部分抑制CRC的發(fā)展
為了探索將PUM1和PUM2作為抗癌治療靶點的可能性，作者利用原位結(jié)腸癌模型進一步研究了裝載siRNA的納米顆粒的體內(nèi)抗腫瘤活性(Fig. 6a)。通過IVIS光譜觀察到siRNA負載的納米顆粒通過增強的滲透性和保留(EPR)效應(yīng)，靶向腫瘤60CT多模態(tài)成像系統(tǒng)(Fig. 6b)。作者將HCT116和COLO205腫瘤細胞植入4周齡雄性BALB/c裸鼠皮下。植入后28天，小鼠的腫瘤生物發(fā)光強度相當(dāng)。這些小鼠每三天通過靜脈注射四次納米顆粒制劑（Fig. 6c)。每周用生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤生長情況（Fig. 6d, h)。對于HCT116腫瘤模型，非特異性siRNA對照(siNC@MSN)不能延緩腫瘤的生長。相反，注射含有抗PUM1的siRNA (siPum1@MSN)或抗PUM2的siRNA (siPum2@MSN)的納米顆粒則能顯著抑制腫瘤的生長。尤其是同時使用抗PUM1和抗PUM2 siRNA的小鼠(siPum1/2@MSN)表現(xiàn)出最強的抗腫瘤作用(Fig. 6e)。實驗結(jié)束時(第30天)，處死小鼠，切除腫瘤并稱重。使用siPum1/2@MSN的小鼠的腫瘤比對照組小3.7-4.0倍(Fig. 6f)。腫瘤重量的減少不是由于明顯的毒性，因為在治療期間，所有組的體重都有相似的增加(Fig. 6g)。此外，si PUM1,2@MSN組在所有被檢查的器官中均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出最佳的抗轉(zhuǎn)移效果。在COLO205小鼠模型中也有類似的抗腫瘤作用(Fig. 6i–k）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，PUM1/2是治療CRC的潛在靶點，納米顆粒遞送PUM1或/和PUM2 siRNA可阻止其進一步生長。
Fig6在攜帶HCT116或COLO205結(jié)直腸腫瘤的小鼠中使用sirna負載的MSN進行體內(nèi)治療
總之， Pum1和Pum2在體內(nèi)和體外細胞生長中都對CRC的致瘤性至關(guān)重要，PUM1和PUM2在人類CRC中表達增加, PUM蛋白可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達來促進結(jié)直腸癌的生長。PUM1和PUM2可作為CRC治療的靶點。
參考文獻：
Gong, Y., et al., PUMILIO proteins promote colorectal cancer growth via suppressing p21. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1627.