小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體miR-466f-3p參與放射性肺損傷的EMT過程

放射性肺纖維化（RILF）是胸部放療的常見并發(fā)癥。肺泡上皮細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在肺纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。來源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體具有修復(fù)和再生受損組織的特性，但其潛在機(jī)制尚不清楚。我們的研究結(jié)果表明，來自于mMSCs的外泌體miR-466f-3p可能具有抗纖維化特性，并通過c-MET抑制AKT/GSK3β來防止放療誘導(dǎo)的EMT，為放療誘導(dǎo)的肺纖維化提供了一種有前途的治療方式。本文于2022年4月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.161）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體的特征

培養(yǎng)3周后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析從骨髓中純化的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs)，其典型的MSC標(biāo)志物CD44、CD90.2和Sca-1陽性表達(dá)。而造血標(biāo)志物如CD34、CD11b和CD45呈陰性(圖1A)。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)培養(yǎng)基下，分離的mMSCs表現(xiàn)出向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化能力(圖1B)。然后，通過標(biāo)準(zhǔn)超離心從條件培養(yǎng)基中分離出外泌體，分別用TEM、納米顆粒跟蹤分析和Western blot方法進(jìn)行鑒定。如圖1C-E所示，典型的外泌體呈圓形形態(tài)，大小為90 ~ 150 nm，陽性表達(dá)常見的外泌體標(biāo)志物CD63、TSG101和CD9。而胞內(nèi)蛋白GM130在外泌體中缺失。隨后，為了評(píng)估來自于mMSCs的外泌體是否被受體細(xì)胞吸收，將PKH67標(biāo)記的mMSCs-exos與小鼠肺泡上皮細(xì)胞MLE-12共培養(yǎng)。我們通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PKH67信號(hào)在MLE-12細(xì)胞質(zhì)中以時(shí)間依賴的方式不斷積累，在孵育4小時(shí)后達(dá)到最大值(圖1F)。

2）mMSCs-Exos可在體外防止放療誘導(dǎo)的肺泡EMT

在放療作用下，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT過程，這被認(rèn)為是RILI發(fā)病的重要機(jī)制。如預(yù)期的那樣，單劑量8 Gy照射的MLE-12細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的形態(tài)變化，照射48 h后，大多數(shù)細(xì)胞從典型的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂醒由靷巫愕募?xì)長間充質(zhì)樣外觀(圖2A)。為了探究mMSCs-Exos在放療誘導(dǎo)的EMT中的作用，我們?cè)?/span>MLE-12細(xì)胞在放療前用mMSCs-Exos預(yù)處理4 h，48 h后用western blot方法分析EMT相關(guān)標(biāo)記物。與放療誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)變化相一致的是，與對(duì)照組細(xì)胞相比，放療后的MLE-12細(xì)胞上皮標(biāo)記物(E-cadherin)明顯減少，間充質(zhì)標(biāo)記物(Vimentin)表達(dá)增強(qiáng)，證實(shí)了EMT形態(tài)的變化(圖2B, C)。預(yù)處理后的mMSCs-Exos明顯逆轉(zhuǎn)了放療誘導(dǎo)的EMT(圖2B, C)。此外，上述EMT相關(guān)蛋白的變化通過免疫熒光進(jìn)一步鑒定(圖2D)。

3）mMSCs-exos可在體內(nèi)防止放療誘導(dǎo)的肺損傷

為了研究其體內(nèi)細(xì)胞保護(hù)作用，我們建立了單劑量14 Gy全胸注射的小鼠RILI模型。治療組小鼠在放療前2 h靜脈注射mMSCs-Exos。有趣的是，H&E染色顯示，在1周、4周、8周和12周時(shí)，給予mMSCs-Exos明顯減輕了放療所致的肺損傷，其中肺泡間隔增厚、間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤等病理損傷明顯減輕。肺泡完整性優(yōu)于單純放療組(圖3A)。值得注意的是，Masson染色進(jìn)一步顯示，在放療12周后，膠原蛋白廣泛沉積，尤其是在血管周圍，而mMSCs-Exos降低了沉積(圖3A, B)。與Masson染色一致，在12周時(shí)，mMSCs-Exos也減弱了放療誘導(dǎo)的肺組織中羥脯氨酸含量的增加(圖3C)。此外，我們通過ELISA檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子。數(shù)據(jù)顯示，雖然IL-1β和IL-6的分泌和釋放在放療12周后顯著增加，但與單純放療組相比，使用mMSCs-Exos顯著抑制了它們的水平(圖3D, E)。此外，免疫組化數(shù)據(jù)顯示，在放療12周后，mMSCs-Exos導(dǎo)致EMT相關(guān)蛋白明顯變化，與單純放療組相比，E-cadherin表達(dá)增加，Vimentin表達(dá)減少(圖3F)。

4）來自mMSCs的外泌體mmu-miR-466f-3p可逆轉(zhuǎn)放療誘導(dǎo)的EMT和肺損傷

鑒于miRNAs的穿梭被認(rèn)為是外泌體的重要功能，我們進(jìn)行了miRNA微陣列來篩選對(duì)IR的保護(hù)作用所需的miRNA。與只接受放療的細(xì)胞相比，在與mMSC-Exos共培養(yǎng)的MLE-12細(xì)胞中觀察到miRNA顯著增加(圖4A)。在前10個(gè)上調(diào)的miRNAs中，mmu-miR-466f-3p (miR-466f-3p)在mMSCs-Exos中表達(dá)最豐富(圖4B)。mMSCs中miR-466f-3p的水平高于MLE-12細(xì)胞，在放療后的MLE-12細(xì)胞中miR-466f-3p的水平顯著下調(diào)(圖4C)。特別地，用mMSCs或mMSCs- exos處理后，miR-466f-3p在放療的MLE12細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。然而，這種趨勢(shì)被外泌體抑制劑GW4869所削弱(圖4D)。此外，為了闡明外泌體miR-466f-3p在放療誘導(dǎo)的EMT中的作用，將miR-466f-3p抑制劑引入到mMSCs中，與scramble轉(zhuǎn)染的mMSCs外泌體(mMSCs-exo/scramble)相比，在mMSCs來源的外泌體(mMSCs-exo/ si-466f-3p)中miR-466f-3p的表達(dá)下降(圖4E)。正如預(yù)期的那樣，miR-466f-3p在scrambled外泌體處理的放療的MLE-12細(xì)胞中的水平高于mMSCs-exo/si-466f-3p處理的細(xì)胞(圖4F)。有趣的是，與scrambled外泌體處理的放療的MLE-12細(xì)胞相比，使用抑制miR-466f-3p的外泌體(mMSCs-exo/si-466f-3p)顯著降低了E-cadherin的表達(dá)，并提高了波形蛋白(圖4G, H)。此外，通過透射電鏡(TEM)顯示，與scrambled外泌體共孵育的放療細(xì)胞仍保持了一些上皮特性，如黏附連接，而miR-466f-3p抑制外泌體處理使細(xì)胞保持分散模式，沒有功能連接(圖4I)。隨后，我們檢測(cè)了外泌體miR-466f-3p在RILI小鼠模型中的預(yù)防作用。放療8周后，H&E和Masson染色顯示，miR-466f-3p抑制外泌體小鼠的病理性肺損傷更為嚴(yán)重，膠原沉積更多(圖4J)。羥脯氨酸評(píng)估顯示，在放療8周后，scrambled外泌體誘導(dǎo)肺組織中含量明顯減少，而miR-466f-3p抑制外泌體處理小鼠的肺中含量顯著增加(圖4K)。此外，miR-466f-3p抑制也導(dǎo)致IL-1β和IL-6水平升高(圖4L)。

5）miR-466f-3p依賴的AKT/GSK3β通路對(duì)放療誘導(dǎo)的EMT至關(guān)重要

為了更好地闡明miR-466f-3p調(diào)控的EMT的分子機(jī)制，我們?cè)?/span>Targetscan、miRmap、PITA和miRanda等公開數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)了miR466f-3p可能的靶點(diǎn)。367個(gè)重疊基因隨后被KEGG分析注釋(圖5A)。有趣的是，PI3K/AKT通路(KEGG mmu04151)是前10個(gè)富集之一，與EMT的誘導(dǎo)有關(guān)(圖5B)。根據(jù)之前的文獻(xiàn)，我們首先研究了MLE-12細(xì)胞中AKT和GSK3β對(duì)放療的響應(yīng)。Western blot分析顯示，單劑量8 Gy照射1小時(shí)后，AKT在絲氨酸473位點(diǎn)明顯磷酸化(p-AKT)，同時(shí)絲氨酸9位點(diǎn)磷酸化GSK3β (p-GSK3β)增加，SNAIL相應(yīng)增加(圖5C, D)。我們?cè)诜暖熐坝肁KT抑制劑LY294002預(yù)處理MLE-12細(xì)胞2小時(shí)。當(dāng)AKT信號(hào)被阻斷時(shí)，放療誘導(dǎo)的GSK-3β的抑制被釋放，這與SNAIL的下調(diào)有關(guān)(圖5 C，D)。AKT抑制劑也可以通過調(diào)節(jié)放療48 h 后E-cadherin和Vimentin的蛋白水平有效逆轉(zhuǎn)放療誘導(dǎo)的EMT(圖5 E，F(xiàn))。根據(jù)上述結(jié)果，我們檢測(cè)了miR-466f-3p和AKT/GSK3β通路之間的潛在關(guān)系。與對(duì)照組相比，在MLE-12細(xì)胞中過表達(dá)miR466f-3p顯著降低了放療后p-AKT和p-GSK3β的強(qiáng)信號(hào)，同時(shí)Snail蛋白減少。而總AKT和GSK3β水平不受影響(圖5G，H)。此外，miR-466f-3p mimic通過恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)明顯減弱放療誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞EMT，而明顯抑制Vimentin的蛋白水平(圖5I，J)。免疫熒光也顯示，與對(duì)照相比，miR-466f-3p mimic同時(shí)逆轉(zhuǎn)了放療誘導(dǎo)的Snail核積累(圖5K)。

6）C-MET是miR-466f-3p的直接靶點(diǎn)，通過AKT/GSK3β通路消除放療誘導(dǎo)的EMT

為了確定miR-466f-3p的關(guān)鍵靶點(diǎn)，上述預(yù)測(cè)基因與PI3K-AKT通路存在重疊。在候選基因中，我們關(guān)注的是c-MET(圖6A)，其在肺纖維化中的作用已被證實(shí)。首先，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-466f-3p與c-MET之間的直接相互作用。我們發(fā)現(xiàn)miR466f-3p模擬物顯著抑制了c-MET野生型3'UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，而當(dāng)載體含有c-MET突變型3'UTR時(shí)，這種抑制作用顯著消失(圖6B)。此外，與NC對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-466f-3p mimic顯著降低了放療的MLE-12細(xì)胞中c-MET蛋白的表達(dá)，而抑制miR-466f-3p的MLE-12細(xì)胞中c-MET的表達(dá)增加(圖6C)。此外，通過siRNA敲除c-MET可以顯著抑制放療誘導(dǎo)的AKT和GSK3β的磷酸化，從而逆轉(zhuǎn)放療的MLE-12細(xì)胞的EMT表型(圖6D，E)。為了進(jìn)一步支持c-MET在mMSCs-exoos介導(dǎo)的EMT過程中的作用，我們將一個(gè)缺乏3’UTR的c-MET表達(dá)載體(pcDNA c-MET)轉(zhuǎn)染到MLE-12細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，鑒定了其異位表達(dá)(圖6F)。如預(yù)期的那樣，過表達(dá)c-MET可減弱mMSCs-Exos處理的MLE-12細(xì)胞中放療誘導(dǎo)的變化，包括p-AKT、p-GSK3β、SNAIL和EMT標(biāo)記物E-cadherin和Vimentin (圖6G，H)。

結(jié)論：我們證明了mMSCs-Exos在體內(nèi)和體外均能減輕放療誘導(dǎo)的肺損傷。特別是，外泌體miR-466f-3p從mMSCs轉(zhuǎn)移到放療損傷的MLE-12細(xì)胞靶向c-MET，從而下調(diào)AKT/GSK3β信號(hào)通路，從而抑制放療誘導(dǎo)的EMT。對(duì)mMSCs-Exos在放療誘導(dǎo)的肺損傷中的作用的了解可能會(huì)改善我們開發(fā)預(yù)防方法的前景。

參考文獻(xiàn)：

Li Y, Shen Z, Jiang X, Wang Y, Yang Z, Mao Y, Wu Z, Li G, Chen H. Mouse mesenchymal stem cell-derived exosomal miR-466f-3p reverses EMT process through inhibiting AKT/GSK3β pathway via c-MET in radiation-induced lung injury. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Apr 7;41(1):128. doi: 10.1186/s13046-022-02351-z.