激活的SUMOylation限制MHC I類抗原呈遞，從而在癌癥中實現(xiàn)免疫逃避

SUMOylation激活是癌癥的標志。近日，有研究發(fā)現(xiàn)活化的SUMOylation (SUMOi)使腫瘤細胞能夠逃避抗腫瘤免疫監(jiān)視：激活的SUMOi通過抑制MHC I類（MHC-I）抗原處理和呈遞機制（APM），使癌細胞能夠逃避CD8+T細胞介導的免疫監(jiān)視。該研究擴大了對SUMOi作為一種提高腫瘤免疫治療療效的合理治療策略的認識。研究發(fā)表在《Journal of Clinical Investigation》，IF：14.808。

技術路線：

主要研究結(jié)果：

1. SUMOi恢復MHC-I抗原加工和傳遞途徑

首先通過流式細胞術篩選了細胞系OCI-Ly1(圖1A)。SUMOi處理的細胞顯示出顯著的MHC-I表達的誘導 (圖1,B和C)。基于B2M是MHC-I APM的核心角色，研究發(fā)現(xiàn)在OCI-Ly1細胞中敲除B2M導致MHC-I表達顯著降低(圖1 D和E)。SUMOi處理增加了OCI-Ly1對照細胞的MHC-I表達，但SUMOi處理并不影響OCI-Ly1 B2MKO細胞的MHC-I表達(圖1E)。此外，SUMOi處理以劑量依賴性的方式誘導OCI-Ly1、SU-DHL-4和SU-DHL-5細胞的MHC-I表達(圖1F)，但不影響SU-DHL-6和Toledo細胞的MHC-I表達(圖1F)。SUMOi還恢復了被激活的B細胞亞型DLBCL細胞系HBL-1、RIVA和TMD8的MHC-I表達(圖1G)，顯示了SUMOylation抑制MHC-I表達的高度保守功能。與對照細胞相比，抑制SUMOylation可誘導多種APM基因的表達，包括編碼免疫蛋白酶體成分(LMP2、LMP7)、與抗原加工相關的肽轉(zhuǎn)運體(TAP1)和MHC-I類分子成分(HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M)(圖1H)。

對SUMOi處理的OCI-Ly1和SU-DHL-4 DLBCL細胞系進行了蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果顯示，SUMOi對MHC-I/APM通路成員HLA-A、HLA-B、B2M、TAP1、TAP1和TABP的誘導（圖2A），且pathway分析進一步證實了這一點（圖2B）。

綜上所述，確定了激活的SUMOylation在限制MHC-I/APM通路中的保守作用，并表明抑制SUMOylation恢復了B細胞淋巴瘤（BCL）細胞中的MHC-I/APM通路。

圖1 SUMOi誘導MHC-I抗原加工呈遞途徑

圖2 SUMOi處理的DLBCL細胞系的MS蛋白組分析

2. MYC誘導的MHC-I/APM通路的抑制依賴于SUMOylation和提供免疫逃避

為了研究由MYC激活觸發(fā)的活化SUMOylation與B細胞淋巴損傷中抗原呈遞的抑制之間的關聯(lián)，分析了NCBI 基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO GSE7897）中的一組mRNA表達數(shù)據(jù)，將WT B細胞與來自Eμ-MYC小鼠的MYC驅(qū)動的BCL進行比較。激活MYC信號與SUMO通路表達增加相關，同時與APM通路抑制相關(圖3A)。此外，GSEA分析顯示，在小鼠MYC驅(qū)動的BCLs中，抗原加工和呈遞通路缺失(圖3、B和C)。MYC的抑制導致了SUMO途徑的抑制和相反的抗原呈遞途徑的誘導(圖3D)。在體內(nèi)淋巴瘤模型中：MHC-I表面表達在淋巴瘤發(fā)生過程中逐漸被抑制(圖3E)，其特征是MYC水平逐漸升高。此外，MYC在OCI-Ly1 DLBCL細胞系中的異位表達降低了MHC-I的表面表達(圖3,F和G)。MYC的誘導直接降低了MHC-I的表面表達(圖3H)，揭示了一種保守的機制。

探討MYC誘導的抑制MHC-I在腫瘤細胞中的功能影響，建立了共培養(yǎng)模型系統(tǒng)：攜帶條件MYC基因的U-2-OS細胞在與特異性識別MHC-I結(jié)合流感肽的CTL共培養(yǎng)之前裝載流感肽（圖3I）。由于MYC的激活，U-2-OS細胞的MHC-I較低，對抗原特異性T細胞殺傷的敏感性較低，這表明細胞的存活率較高，凋亡率較低(圖3J)。在U-2-OS、P493-6和OCI-Ly1細胞系中，通過SUMOi處理，MYC誘導的MHC-I抑制完全恢復(圖3,K M)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，MYC誘導的MHC-I抑制逃避了CD8+ T細胞的免疫監(jiān)視，確定了MHC-I豐度和功能的調(diào)節(jié)機制，SUMOi可以恢復這一機制。

圖3 MYC驅(qū)動的MHC-I/APM通路抑制可導致免疫逃避，并可被SUMOi恢復

3. 活化的SUMOylation與腫瘤浸潤T細胞相關

MYC和UBA2表達與黑色素瘤患者中CD8+ T細胞的存在呈負相關，為了檢驗DLBCL患者的這種相關性，作者分析了原發(fā)性DLBCL患者樣本中SUMO核心機制的表達，并確定了一個SUMOhi和一個SUMOlo人群(圖4A)。SUMOhi亞組中浸潤腫瘤的CD8+ T細胞的比例顯著降低(圖4B)。作者進一步用SUMOi或載體對照治療攜帶同基因CT-26腫瘤細胞的小鼠，以產(chǎn)生SUMOi對T細胞浸潤作用的直接實驗證據(jù)(圖4C)。SUMOi治療導致了CT-26腫瘤細胞MHC-I (H-2kd)表達的顯著誘導(圖4,D和E)，這與腫瘤浸潤T細胞的激活有關(圖4,F和G)。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了腫瘤細胞中激活的SUMOylation與腫瘤浸潤T細胞的豐富和低活性相關，SUMOi可以增強這些細胞的活性。

圖4活化的SUMOylation與腫瘤浸潤T細胞相關

4. 激活的SUMOylation限制細胞因子依賴的MHC-I的誘導

基于SUMOi抑制STAT1的磷酸化和細胞對IFN-γ的反應性，但在DLBCL細胞系中，SUMOi大幅擴增IFN-γ誘導MHC-I的誘導(圖5,A和B)。抑制SUMOylation會放大IFN-γ誘導STAT1磷酸化(圖5C)，并直接增加STAT1蛋白和轉(zhuǎn)錄本豐度(圖2A，圖5C, E)，從而啟動IFN-γ信號的STAT1通路。

接下來，為了基于SUMOylation的限制IFN-γ誘導的MHC-I表達是否是癌癥的一般機制。應用單樣本基因集富集分析（ssGSEA），并根據(jù)抗原處理和呈遞核心機制的活性對癌癥細胞系百科全書（CCLE）中代表的所有腫瘤類型進行分類（圖5F）。研究發(fā)現(xiàn)SUMOylation在沉默MHC-I/APM通路的保守作用，且藥理抑制SUMOylation顯著放大IFN-γ依賴性的MHC-I在骨肉瘤，神經(jīng)母細胞瘤，乳腺癌和肺癌細胞中的水平(圖5G)。當SUMO1和SUMO2/3耗盡時，STAT1水平升高(圖5H)，但只有SUMO2/3耗盡的細胞誘導了MHC-I的表達(圖6A)?？傊?，激活的SUMOylation抑制了細胞因子依賴的MHC-I的誘導，并確定了一種附加的SUMO介導的機制，在癌癥中調(diào)節(jié)MHC-I/APM通路的基礎抑制。

圖5激活的SUMOylation限制細胞因子依賴MHC-I的誘導

5. MYC誘導的SUMO2/3修飾SAFB與MHC-I抑制有關

為了進一步探索MYC誘導的SUMO2/3介導的MHC-I抑制機制（圖6A），旨在確定MYC誘導的SUMOylation的細胞靶點。使用anti-SUMO2 IP從Lys-c消化的細胞裂解液中富集了SUMO2/3修飾的多肽，并使用無標記的MS方法進一步分析AspN消化的多肽，確定了SUMO2/3位點(圖6B)。通過一種互補的多肽串聯(lián)質(zhì)量標記方法，在29個蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了31個位點，顯示出至少2倍的誘導(圖6C)。兩組數(shù)據(jù)中都有14個蛋白，包括轉(zhuǎn)錄共抑制因子SAFB和SAFB2(圖6C)，它們作為包括MHC-I基因在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)因子的抑制因子。

另外，在對照細胞而非SUMOi處理細胞的全細胞裂解液中，檢測到一個更高分子的抗SAFB反應條帶(圖6D)。SAFB偶聯(lián)物在SUMO2/3 IPs中高度富集，但在經(jīng)過SUMOi處理的樣品中完全缺失，這表明它與SUMOylation SAFB相對應(圖6D)。為了進一步驗證MYC可以誘導SAFB的SUMOylation，SUMOi也可以阻止這種誘導，在對照組細胞和表達MYC的細胞中進行了抗SUMO2 /3 IP實驗。與MS數(shù)據(jù)一致的是，在MYC誘導時，SAFB-SUMO2/3偶聯(lián)物水平顯著升高，而SUMOi完全削弱了這一效應(圖6E)。SAFB賴氨酸294位點的SUMOylation，鑒定為一個MYC誘導的MS位點 (圖6E)。此外，抑制SUMOylation也影響SAFB蛋白水平，而SAFB2蛋白水平不受影響(圖6,F H)。另外，減少SAFB可顯著增加MHC-I的表達(圖6I)?？傊?，該研究發(fā)現(xiàn)了新的SUMO介導的MHC-I/APM通路基礎抑制機制，SAFB作為其SUMO調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制因子。

圖6 MYC誘導的SAFB的SUMOylation抑制MHC-I/APM通路

6. SUMOi驅(qū)動前饋回路，放大抗腫瘤免疫反應

具有SUMOi恢復的MHC-I表面水平的DLBCL細胞比對照細胞對T細胞殺傷更敏感，這表明SUMOi恢復的MHC-I表達對抗腫瘤免疫反應具有功能性影響(圖7A)。SUMOi處理的CD8+ CTLs產(chǎn)生顯著更高水平的IFN-γ，表明T細胞活化增加(圖7B)。此外，活化的T細胞產(chǎn)生的細胞因子進一步增強了癌細胞上MHC-I的表達(圖7C)，這通常會促進CD8+ T細胞的活化和細胞因子的產(chǎn)生。因此，與對照腫瘤細胞共培養(yǎng)相比，SUMOi預處理的腫瘤細胞與CD8+ T細胞共培養(yǎng)可以增強T細胞的活化，IFN-γ的產(chǎn)生增加(圖7D)。SUMOi介導的MHC-I的誘導和SUMOi誘導的CD8+ T細胞的激活驅(qū)動一個前饋回路，這放大了在單獨系統(tǒng)中觀察到的SUMOi的作用(圖7E)。用SUMOi和IFN-γ預處理DLBCL細胞，以最大限度地誘導MHC-I/APM通路，發(fā)現(xiàn)SUMOi和IFN-γ聯(lián)合使用對CTL誘導的細胞溶解的敏感性最高(圖7F)。最后，為了測試SUMOi作為MHC-I表達誘導劑的體內(nèi)潛力，用SUMOi處理WT小鼠，分析MHC-I的表達(圖7G)。盡管小鼠WT B細胞的MHC-I高表達，但SUMOi又顯著增強了MHC-I的表達(圖7G)，并且在SUMOi處理的小鼠中未觀察到任何毒性跡象(圖7H)?？傊@些數(shù)據(jù)確定了一個SUMOi驅(qū)動的前饋回路，可以放大抗腫瘤免疫反應。

圖7 SUMOi驅(qū)動前饋回路，放大抗腫瘤免疫反應

7. SUMOi改變了全球免疫系統(tǒng)的格局

為了系統(tǒng)地評估SUMOi在造血細胞中的作用，通過測序(CITE-Seq)對轉(zhuǎn)錄組和表位進行了細胞索引。對照組和SUMOi處理小鼠的脾臟細胞(圖7G)用寡偶聯(lián)抗體進行標記，以區(qū)分不同的B細胞和T細胞亞群，然后在10x Genomics平臺上進行轉(zhuǎn)錄組學和表面蛋白質(zhì)組學分析。作者確定了脾臟中普遍存在的所有主要細胞群或分化階段(圖8A)。揭示了體內(nèi)SUMOi治療后免疫系統(tǒng)的重大重構，從而強調(diào)了SUMOi靶向干預的廣泛影響和復雜性(圖8A-D)。具體來說，CD4+和CD8+ T細胞以及B細胞的豐度較低(圖8D-G)，而在SUMOi處理的小鼠中，NK細胞以及早期和晚期中性粒細胞的豐度顯著較高(圖8D-H)。在CD4+和CD8+ T細胞中，I型和II型IFN信號通路被激活，激活的T細胞亞群數(shù)量增加 (圖8E-G, J和K)。抑制SUMO在轉(zhuǎn)錄上誘導了非惡性脾B細胞的APM，并導致了I型和II型IFN信號的全面誘導 (圖8I)。除此之外，這些數(shù)據(jù)揭示了SUMOi治療在免疫領域的驚人復雜性，并表明SUMOi通過多種機制影響免疫反應。

圖8 SUMOi改變了全球免疫系統(tǒng)的格局

結(jié)論：

在本研究中，SUMOi通過轉(zhuǎn)錄誘導MHC-I APM來增強腫瘤細胞的免疫原性。結(jié)合SUMOi驅(qū)動的CD8+ T細胞的激活，提出了一種SUMOi依賴的前饋機制，以增強抗腫瘤免疫。確立了SUMOi在癌癥領域的雙靶向策略的概念。從臨床角度來看，高免疫原性腫瘤細胞經(jīng)常被免疫系統(tǒng)消滅。這個過程被稱為免疫編輯，有利于免疫原性較低的癌細胞的生長，是癌癥免疫治療耐藥性的一個既定原因。因此，增強腫瘤細胞的免疫原性具有特殊的治療意義，以抑制SUMOylation反應作為一種治療策略，以增強免疫治療在癌癥中的療效。