激活的SUMOylation限制MHC I類抗原呈遞，從而在癌癥中實(shí)現(xiàn)免疫逃避

SUMOylation激活是癌癥的標(biāo)志。近日，有研究發(fā)現(xiàn)活化的SUMOylation (SUMOi)使腫瘤細(xì)胞能夠逃避抗腫瘤免疫監(jiān)視：激活的SUMOi通過抑制MHC I類（MHC-I）抗原處理和呈遞機(jī)制（APM），使癌細(xì)胞能夠逃避CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視。該研究擴(kuò)大了對(duì)SUMOi作為一種提高腫瘤免疫治療療效的合理治療策略的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)表在《Journal of Clinical Investigation》，IF：14.808。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. SUMOi恢復(fù)MHC-I抗原加工和傳遞途徑

首先通過流式細(xì)胞術(shù)篩選了細(xì)胞系OCI-Ly1(圖1A)。SUMOi處理的細(xì)胞顯示出顯著的MHC-I表達(dá)的誘導(dǎo) (圖1,B和C)?；贐2M是MHC-I APM的核心角色，研究發(fā)現(xiàn)在OCI-Ly1細(xì)胞中敲除B2M導(dǎo)致MHC-I表達(dá)顯著降低(圖1 D和E)。SUMOi處理增加了OCI-Ly1對(duì)照細(xì)胞的MHC-I表達(dá)，但SUMOi處理并不影響OCI-Ly1 B2MKO細(xì)胞的MHC-I表達(dá)(圖1E)。此外，SUMOi處理以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)OCI-Ly1、SU-DHL-4和SU-DHL-5細(xì)胞的MHC-I表達(dá)(圖1F)，但不影響SU-DHL-6和Toledo細(xì)胞的MHC-I表達(dá)(圖1F)。SUMOi還恢復(fù)了被激活的B細(xì)胞亞型DLBCL細(xì)胞系HBL-1、RIVA和TMD8的MHC-I表達(dá)(圖1G)，顯示了SUMOylation抑制MHC-I表達(dá)的高度保守功能。與對(duì)照細(xì)胞相比，抑制SUMOylation可誘導(dǎo)多種APM基因的表達(dá)，包括編碼免疫蛋白酶體成分(LMP2、LMP7)、與抗原加工相關(guān)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP1)和MHC-I類分子成分(HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M)(圖1H)。

對(duì)SUMOi處理的OCI-Ly1和SU-DHL-4 DLBCL細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，SUMOi對(duì)MHC-I/APM通路成員HLA-A、HLA-B、B2M、TAP1、TAP1和TABP的誘導(dǎo)（圖2A），且pathway分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖2B）。

綜上所述，確定了激活的SUMOylation在限制MHC-I/APM通路中的保守作用，并表明抑制SUMOylation恢復(fù)了B細(xì)胞淋巴瘤（BCL）細(xì)胞中的MHC-I/APM通路。

圖1 SUMOi誘導(dǎo)MHC-I抗原加工呈遞途徑

圖2 SUMOi處理的DLBCL細(xì)胞系的MS蛋白組分析

2. MYC誘導(dǎo)的MHC-I/APM通路的抑制依賴于SUMOylation和提供免疫逃避

為了研究由MYC激活觸發(fā)的活化SUMOylation與B細(xì)胞淋巴損傷中抗原呈遞的抑制之間的關(guān)聯(lián)，分析了NCBI 基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO GSE7897）中的一組mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，將WT B細(xì)胞與來自Eμ-MYC小鼠的MYC驅(qū)動(dòng)的BCL進(jìn)行比較。激活MYC信號(hào)與SUMO通路表達(dá)增加相關(guān)，同時(shí)與APM通路抑制相關(guān)(圖3A)。此外，GSEA分析顯示，在小鼠MYC驅(qū)動(dòng)的BCLs中，抗原加工和呈遞通路缺失(圖3、B和C)。MYC的抑制導(dǎo)致了SUMO途徑的抑制和相反的抗原呈遞途徑的誘導(dǎo)(圖3D)。在體內(nèi)淋巴瘤模型中：MHC-I表面表達(dá)在淋巴瘤發(fā)生過程中逐漸被抑制(圖3E)，其特征是MYC水平逐漸升高。此外，MYC在OCI-Ly1 DLBCL細(xì)胞系中的異位表達(dá)降低了MHC-I的表面表達(dá)(圖3,F和G)。MYC的誘導(dǎo)直接降低了MHC-I的表面表達(dá)(圖3H)，揭示了一種保守的機(jī)制。

探討MYC誘導(dǎo)的抑制MHC-I在腫瘤細(xì)胞中的功能影響，建立了共培養(yǎng)模型系統(tǒng)：攜帶條件MYC基因的U-2-OS細(xì)胞在與特異性識(shí)別MHC-I結(jié)合流感肽的CTL共培養(yǎng)之前裝載流感肽（圖3I）。由于MYC的激活，U-2-OS細(xì)胞的MHC-I較低，對(duì)抗原特異性T細(xì)胞殺傷的敏感性較低，這表明細(xì)胞的存活率較高，凋亡率較低(圖3J)。在U-2-OS、P493-6和OCI-Ly1細(xì)胞系中，通過SUMOi處理，MYC誘導(dǎo)的MHC-I抑制完全恢復(fù)(圖3,K M)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，MYC誘導(dǎo)的MHC-I抑制逃避了CD8+ T細(xì)胞的免疫監(jiān)視，確定了MHC-I豐度和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，SUMOi可以恢復(fù)這一機(jī)制。

圖3 MYC驅(qū)動(dòng)的MHC-I/APM通路抑制可導(dǎo)致免疫逃避，并可被SUMOi恢復(fù)

3. 活化的SUMOylation與腫瘤浸潤T細(xì)胞相關(guān)

MYC和UBA2表達(dá)與黑色素瘤患者中CD8+ T細(xì)胞的存在呈負(fù)相關(guān)，為了檢驗(yàn)DLBCL患者的這種相關(guān)性，作者分析了原發(fā)性DLBCL患者樣本中SUMO核心機(jī)制的表達(dá)，并確定了一個(gè)SUMOhi和一個(gè)SUMOlo人群(圖4A)。SUMOhi亞組中浸潤腫瘤的CD8+ T細(xì)胞的比例顯著降低(圖4B)。作者進(jìn)一步用SUMOi或載體對(duì)照治療攜帶同基因CT-26腫瘤細(xì)胞的小鼠，以產(chǎn)生SUMOi對(duì)T細(xì)胞浸潤作用的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)(圖4C)。SUMOi治療導(dǎo)致了CT-26腫瘤細(xì)胞MHC-I (H-2kd)表達(dá)的顯著誘導(dǎo)(圖4,D和E)，這與腫瘤浸潤T細(xì)胞的激活有關(guān)(圖4,F和G)。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了腫瘤細(xì)胞中激活的SUMOylation與腫瘤浸潤T細(xì)胞的豐富和低活性相關(guān)，SUMOi可以增強(qiáng)這些細(xì)胞的活性。

圖4活化的SUMOylation與腫瘤浸潤T細(xì)胞相關(guān)

4. 激活的SUMOylation限制細(xì)胞因子依賴的MHC-I的誘導(dǎo)

基于SUMOi抑制STAT1的磷酸化和細(xì)胞對(duì)IFN-γ的反應(yīng)性，但在DLBCL細(xì)胞系中，SUMOi大幅擴(kuò)增IFN-γ誘導(dǎo)MHC-I的誘導(dǎo)(圖5,A和B)。抑制SUMOylation會(huì)放大IFN-γ誘導(dǎo)STAT1磷酸化(圖5C)，并直接增加STAT1蛋白和轉(zhuǎn)錄本豐度(圖2A，圖5C, E)，從而啟動(dòng)IFN-γ信號(hào)的STAT1通路。

接下來，為了基于SUMOylation的限制IFN-γ誘導(dǎo)的MHC-I表達(dá)是否是癌癥的一般機(jī)制。應(yīng)用單樣本基因集富集分析（ssGSEA），并根據(jù)抗原處理和呈遞核心機(jī)制的活性對(duì)癌癥細(xì)胞系百科全書（CCLE）中代表的所有腫瘤類型進(jìn)行分類（圖5F）。研究發(fā)現(xiàn)SUMOylation在沉默MHC-I/APM通路的保守作用，且藥理抑制SUMOylation顯著放大IFN-γ依賴性的MHC-I在骨肉瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，乳腺癌和肺癌細(xì)胞中的水平(圖5G)。當(dāng)SUMO1和SUMO2/3耗盡時(shí)，STAT1水平升高(圖5H)，但只有SUMO2/3耗盡的細(xì)胞誘導(dǎo)了MHC-I的表達(dá)(圖6A)。總之，激活的SUMOylation抑制了細(xì)胞因子依賴的MHC-I的誘導(dǎo)，并確定了一種附加的SUMO介導(dǎo)的機(jī)制，在癌癥中調(diào)節(jié)MHC-I/APM通路的基礎(chǔ)抑制。

圖5激活的SUMOylation限制細(xì)胞因子依賴MHC-I的誘導(dǎo)

5. MYC誘導(dǎo)的SUMO2/3修飾SAFB與MHC-I抑制有關(guān)

為了進(jìn)一步探索MYC誘導(dǎo)的SUMO2/3介導(dǎo)的MHC-I抑制機(jī)制（圖6A），旨在確定MYC誘導(dǎo)的SUMOylation的細(xì)胞靶點(diǎn)。使用anti-SUMO2 IP從Lys-c消化的細(xì)胞裂解液中富集了SUMO2/3修飾的多肽，并使用無標(biāo)記的MS方法進(jìn)一步分析AspN消化的多肽，確定了SUMO2/3位點(diǎn)(圖6B)。通過一種互補(bǔ)的多肽串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)記方法，在29個(gè)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了31個(gè)位點(diǎn)，顯示出至少2倍的誘導(dǎo)(圖6C)。兩組數(shù)據(jù)中都有14個(gè)蛋白，包括轉(zhuǎn)錄共抑制因子SAFB和SAFB2(圖6C)，它們作為包括MHC-I基因在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)因子的抑制因子。

另外，在對(duì)照細(xì)胞而非SUMOi處理細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液中，檢測到一個(gè)更高分子的抗SAFB反應(yīng)條帶(圖6D)。SAFB偶聯(lián)物在SUMO2/3 IPs中高度富集，但在經(jīng)過SUMOi處理的樣品中完全缺失，這表明它與SUMOylation SAFB相對(duì)應(yīng)(圖6D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MYC可以誘導(dǎo)SAFB的SUMOylation，SUMOi也可以阻止這種誘導(dǎo)，在對(duì)照組細(xì)胞和表達(dá)MYC的細(xì)胞中進(jìn)行了抗SUMO2 /3 IP實(shí)驗(yàn)。與MS數(shù)據(jù)一致的是，在MYC誘導(dǎo)時(shí)，SAFB-SUMO2/3偶聯(lián)物水平顯著升高，而SUMOi完全削弱了這一效應(yīng)(圖6E)。SAFB賴氨酸294位點(diǎn)的SUMOylation，鑒定為一個(gè)MYC誘導(dǎo)的MS位點(diǎn) (圖6E)。此外，抑制SUMOylation也影響SAFB蛋白水平，而SAFB2蛋白水平不受影響(圖6,F H)。另外，減少SAFB可顯著增加MHC-I的表達(dá)(圖6I)?？傊撗芯堪l(fā)現(xiàn)了新的SUMO介導(dǎo)的MHC-I/APM通路基礎(chǔ)抑制機(jī)制，SAFB作為其SUMO調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制因子。

圖6 MYC誘導(dǎo)的SAFB的SUMOylation抑制MHC-I/APM通路

6. SUMOi驅(qū)動(dòng)前饋回路，放大抗腫瘤免疫反應(yīng)

具有SUMOi恢復(fù)的MHC-I表面水平的DLBCL細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞殺傷更敏感，這表明SUMOi恢復(fù)的MHC-I表達(dá)對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)具有功能性影響(圖7A)。SUMOi處理的CD8+ CTLs產(chǎn)生顯著更高水平的IFN-γ，表明T細(xì)胞活化增加(圖7B)。此外，活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)一步增強(qiáng)了癌細(xì)胞上MHC-I的表達(dá)(圖7C)，這通常會(huì)促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，與對(duì)照腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)相比，SUMOi預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)可以增強(qiáng)T細(xì)胞的活化，IFN-γ的產(chǎn)生增加(圖7D)。SUMOi介導(dǎo)的MHC-I的誘導(dǎo)和SUMOi誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞的激活驅(qū)動(dòng)一個(gè)前饋回路，這放大了在單獨(dú)系統(tǒng)中觀察到的SUMOi的作用(圖7E)。用SUMOi和IFN-γ預(yù)處理DLBCL細(xì)胞，以最大限度地誘導(dǎo)MHC-I/APM通路，發(fā)現(xiàn)SUMOi和IFN-γ聯(lián)合使用對(duì)CTL誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解的敏感性最高(圖7F)。最后，為了測試SUMOi作為MHC-I表達(dá)誘導(dǎo)劑的體內(nèi)潛力，用SUMOi處理WT小鼠，分析MHC-I的表達(dá)(圖7G)。盡管小鼠WT B細(xì)胞的MHC-I高表達(dá)，但SUMOi又顯著增強(qiáng)了MHC-I的表達(dá)(圖7G)，并且在SUMOi處理的小鼠中未觀察到任何毒性跡象(圖7H)?？傊?，這些數(shù)據(jù)確定了一個(gè)SUMOi驅(qū)動(dòng)的前饋回路，可以放大抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖7 SUMOi驅(qū)動(dòng)前饋回路，放大抗腫瘤免疫反應(yīng)

7. SUMOi改變了全球免疫系統(tǒng)的格局

為了系統(tǒng)地評(píng)估SUMOi在造血細(xì)胞中的作用，通過測序(CITE-Seq)對(duì)轉(zhuǎn)錄組和表位進(jìn)行了細(xì)胞索引。對(duì)照組和SUMOi處理小鼠的脾臟細(xì)胞(圖7G)用寡偶聯(lián)抗體進(jìn)行標(biāo)記，以區(qū)分不同的B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群，然后在10x Genomics平臺(tái)上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表面蛋白質(zhì)組學(xué)分析。作者確定了脾臟中普遍存在的所有主要細(xì)胞群或分化階段(圖8A)。揭示了體內(nèi)SUMOi治療后免疫系統(tǒng)的重大重構(gòu)，從而強(qiáng)調(diào)了SUMOi靶向干預(yù)的廣泛影響和復(fù)雜性(圖8A-D)。具體來說，CD4+和CD8+ T細(xì)胞以及B細(xì)胞的豐度較低(圖8D-G)，而在SUMOi處理的小鼠中，NK細(xì)胞以及早期和晚期中性粒細(xì)胞的豐度顯著較高(圖8D-H)。在CD4+和CD8+ T細(xì)胞中，I型和II型IFN信號(hào)通路被激活，激活的T細(xì)胞亞群數(shù)量增加 (圖8E-G, J和K)。抑制SUMO在轉(zhuǎn)錄上誘導(dǎo)了非惡性脾B細(xì)胞的APM，并導(dǎo)致了I型和II型IFN信號(hào)的全面誘導(dǎo) (圖8I)。除此之外，這些數(shù)據(jù)揭示了SUMOi治療在免疫領(lǐng)域的驚人復(fù)雜性，并表明SUMOi通過多種機(jī)制影響免疫反應(yīng)。

圖8 SUMOi改變了全球免疫系統(tǒng)的格局

結(jié)論：

在本研究中，SUMOi通過轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)MHC-I APM來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。結(jié)合SUMOi驅(qū)動(dòng)的CD8+ T細(xì)胞的激活，提出了一種SUMOi依賴的前饋機(jī)制，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫。確立了SUMOi在癌癥領(lǐng)域的雙靶向策略的概念。從臨床角度來看，高免疫原性腫瘤細(xì)胞經(jīng)常被免疫系統(tǒng)消滅。這個(gè)過程被稱為免疫編輯，有利于免疫原性較低的癌細(xì)胞的生長，是癌癥免疫治療耐藥性的一個(gè)既定原因。因此，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性具有特殊的治療意義，以抑制SUMOylation反應(yīng)作為一種治療策略，以增強(qiáng)免疫治療在癌癥中的療效。