在胰管腺癌中，LncRNA-PACERR通過與miR-671-3p和m6A-reader IGF2BP2相互作用誘導(dǎo)腫瘤前巨噬細(xì)胞

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時間：2022-05-30
有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-PACERR是PDAC TME中TAMs的關(guān)鍵調(diào)控因子，并揭示了其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的新機(jī)制......


胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是胰腺癌的主要類型，是最具侵襲性和致命性的消化道惡性腫瘤，預(yù)后極差。PDAC的嚴(yán)重預(yù)后與腫瘤微環(huán)境（TME）相關(guān)，其中組織相關(guān)的巨噬細(xì)胞（TAM）是PDAC TME中主要的免疫細(xì)胞。目前，有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-PACERR是PDAC TME中TAMs的關(guān)鍵調(diào)控因子，并揭示了其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的新機(jī)制。該研究于2022年5月7日發(fā)表在《Journal of Hematology & Oncology》，IF：17.388。


技術(shù)路線：


主要研究結(jié)果：

1. LncRNA-PACERR在TAMs中過表達(dá)，PACERR+ TAMs浸潤升高與PDAC患者預(yù)后不良相關(guān)

為了確定PDAC中TAMs中LncRNA-PACERR的表達(dá)水平，使用磁激活細(xì)胞分選（MACS）從46名PDAC患者的癌旁組織中分離出CD163+細(xì)胞和CD80+細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞的體積為0.5 cm3。通過流式細(xì)胞儀分析確保了分選細(xì)胞的高純度（圖1b）。對腫瘤組織和非腫瘤組織組成的PDAC組織微陣列（TMAs）的FISH免疫熒光分析表明，LncRNA-PACERR在TAMs中的表達(dá)明顯高于正常組織常駐巨噬細(xì)胞（M1-NTRMs） （圖1c，d），并且CD163和LncRNA-PACERR之間存在很強的共定位關(guān)系（圖1e）。Kaplan-Meier分析顯示LncRNA-PACERR+ TAMs高浸潤與PDAC預(yù)后不良相關(guān) （圖1f）。綜上所述，這些結(jié)果表明LncRNA-PACERR+ TAMs越多，PDAC預(yù)后越差。


圖1 TAMs中LncRNA-PACERR表達(dá)在PDAC組織中被激活，與預(yù)后不良相關(guān)


2. LncRNA-PACERR+ TAMs具有M2極化巨噬細(xì)胞的特征，在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為了明確PACERR的功能，利用THP-1細(xì)胞系和PATU-8988/PANC-1細(xì)胞構(gòu)建TAMs體外共培養(yǎng)模型（圖2a）。qPCR分析證實，TAMs敲除LncRNA-PACERR后，M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、CD163、Arginase-1、TGF-β、IL-10、IL-6表達(dá)水平下調(diào)（圖2a）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，THP-1來源的TAMs中LncRNA-PACERR表達(dá)減少，導(dǎo)致CD206+和CD163+巨噬細(xì)胞比例降低（圖2b）?；诳寺⌒纬珊?/span>CCK8實驗，TAMs中LncRNA-PACERR敲低可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖（圖2c）。Transwell實驗表明TAMs中LncRNA-PACERR增加了胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2d， e）。用兩組小鼠來展示小鼠的預(yù)后，觀察到LncRNA-PACERR敲低組小鼠的總生存期較陰性對照組小鼠更長（圖3a-e）。對于轉(zhuǎn)移小鼠模型，其皮下腫瘤模型和轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞數(shù)量減少，CD163+細(xì)胞的數(shù)量和CD206 +細(xì)胞轉(zhuǎn)移焦點在TAMs中LncRNA-PACERR敲除后降低（圖3h-f）。


圖2 LncRNA-PACERR的敲低在體外抑制THP -1衍生的TAMs的M2極化和促腫瘤功能


圖3在體內(nèi)LncRNA-PACERR+ TAMs促進(jìn)PDAC細(xì)胞生長和肝轉(zhuǎn)移


3. LncRNA-PACERR通過吸附miR-671-3p上調(diào)KLF12/p-AKT/c-myc軸

LncRNA-PACERR促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制：通過FISH和細(xì)胞分離實驗確定了LncRNA-PACERR的亞細(xì)胞位置，揭示了LncRNA-PACERR在TAMs細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的主要分布（圖4a-d）。qPCR檢測了兩個假定的LncRNA-PACERR靶標(biāo)miRNA （miR-4448和miR-671-3p） （圖4e）。在THP-1衍生的TAMs中，敲低LncRNA-PACERR后，miR-671-3p上調(diào)，而miR-4448未發(fā)生變化（圖4e）。因此選擇miR-671-3p進(jìn)行進(jìn)一步研究。作者發(fā)現(xiàn)LncRNA-PACERR對pri-miRNA或pre-miRNA的表達(dá)或啟動子活性沒有顯著影響（圖4f-h）。RIP結(jié)果顯示，AGO2顯著結(jié)合LncRNA-PACERR和miR-671-3p（圖4i）。雙熒光素酶報告基因檢測確定了miR-671-3p與LncRNA-PACERR的相互作用（圖4j，k）。此外，利用臨床樣本檢測LncRNA-PACERR和miR-671-3p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-671-3p在TAMs中的表達(dá)低于M1-NTRMs，并且與LncRNA-PACERR呈負(fù)相關(guān)（圖4i， m）。為評估miR-671-3p的臨床預(yù)后，對PDAC TMAs的患者進(jìn)行分組，分為miR-671-3p+高組和miR-671-3p+低組（圖4n）。Kaplan-Meier分析顯示，miR-671-3p表達(dá)越高，PDAC的預(yù)后越好（圖4n）。另外，作者對PDAC中報道過的最著名的靶基因KLF12，進(jìn)行了確認(rèn)（圖5a）。qPCR分析和IF分析證實，KLF12在TAMs中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)（圖5b）。為了探究miR-671-3p是否可以直接海綿化KLF12，首先測定PDAC樣本中miR-671-3p的RNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)KLF12與miR-671-3p之間存在負(fù)相關(guān) （圖5c）。此外，在THP-1衍生的TAMs中，轉(zhuǎn)染miR-671-3p模擬物后KLF12 mRNA表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)染miR-671-3p抑制劑后KLF12 mRNA表達(dá)水平升高（圖5d）。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，用miR-671-3p模擬物轉(zhuǎn)染HEK-293 T細(xì)胞后，Luc-KLF12-wt組的熒光素酶活性降低，而Luc-KLF12-mut組的熒光素酶活性沒有變化（圖5e， f）。此外，在TAMs中，KLF12的表達(dá)與LncRNA-PACERR的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖5g）。轉(zhuǎn)染miR-671-3p抑制劑后，LncRNA-PACERR敲低，可挽救THP-1中KLF12的表達(dá)（圖5h， i）。轉(zhuǎn)染LncRNA-PACERR過表達(dá)質(zhì)粒增加了Luc-KLF12-wt的熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染LncRNA-PACERR和miR-671-3p模擬物減弱了HEK-293 T的這種作用（圖5j）。western blot分析顯示LncRNA-PACERR調(diào)控KLF12顯著促進(jìn)AKT磷酸化，通過下調(diào)THP-1衍生的TAMs中的PTEN增加c-myc的表達(dá)（圖5k， l）。qPCR、流式細(xì)胞術(shù)、CCK8、集散形成和Transwell實驗得到與LncRNA PACERR相似的結(jié)果，并且過表達(dá)KLF12可以促進(jìn)LncRNA-PACERR的表達(dá)（圖5m）。綜上所述，LncRNA-PACERR可以通過隔離miR-671-3p來釋放KLF12，從而通過KLF12/AKT/c-myc通路實現(xiàn)TAMs促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展。


圖4 LncRNA-PACERR在TAMs中作為ceRNA海綿作用于miR-671-3p


圖5 MiR-671-3p直接結(jié)合KLF12的3'UTR，調(diào)控KLF12/AKT/c-myc軸


4. KLF12/LncRNA-PACERR復(fù)合物通過招募EP300來促進(jìn)LncRNA - PACERR在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄

根據(jù)圖5m推測KLF12可能促進(jìn)LncRNA-PACERR在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。通過ChIP實驗確定KLF12與TAMs中LncRNA-PACERR啟動子區(qū)結(jié)合（圖6a）。根據(jù)KLF12的motif預(yù)測了LncRNA-PACERR啟動子區(qū)域的結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)KLF12結(jié)合在LncRNA-PACERR上游的-302—+ 100bp處（圖6b-d）。鑒于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子通過影響組蛋白修飾來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，因此通過ChIP分析確定KLF12在TAMs中LncRNA-PACERR的TSS處增加了H3K27ac的富集（圖6f）。因此，co-IP實驗驗證了KLF12會招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶EP300 （圖6g）。RNA-pull down和RIP實驗驗證KLF12會與細(xì)胞核內(nèi)的LncRNA-PACERR結(jié)合 （圖6h， i）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LncRNA-PACERR也直接受到KLF12的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。


圖6 KLF12直接與LncRNA-PACERR結(jié)合，并以LncRNA-PACERR依賴的方式將EP300招募到LncRNA-PACERR啟動子區(qū)域


5. LncRNA-PACERR在TAMs中通過與IGF2BP2協(xié)同發(fā)揮致癌作用

首先通過RNA-pull down和質(zhì)譜分析來篩選出于LncRNA-PACERR相互作用的m6a相關(guān)蛋白-IGF2BP2（圖7a）。然后，進(jìn)一步驗證了IGF2BP2作為LncRNA-PACERR的RNA結(jié)合蛋白（圖7b）。另外，RIP實驗也證實了IGF2BP2與LncRNA-PACERR之間的關(guān)系（圖7c）。此外，THP-1驅(qū)動的TAMs中LncRNA-PACERR FISH和IGF2BP2的共定位分析支持了它們的相互作用（圖7d）。RNA pull-down和western blot分析確定LncRNA-PACERR的1-293nt區(qū)域與IGF2BP2相互作用（圖7e， f）。最后，構(gòu)建了含有標(biāo)記截短和全長IGF2BP2的HEK-293 T細(xì)胞，并通過RIPqPCR檢測發(fā)現(xiàn)，KH1和KH2結(jié)構(gòu)域?qū)?/span>LncRNA-PACERR的招募具有決定性作用（圖7g，h）。而qPCR、western blot、FISH和IF檢測，LncRNA-PACERR和IGF2BP2彼此的表達(dá)水平并不改變（圖7d， j， k）。這些結(jié)果表明LncRNA-PACERR與IGF2BP2存在物理結(jié)合作用。


圖7 TAMs中LncRNA-PACERR直接與IGF2BP2結(jié)合


6. LncRNA-PACERR通過與IGF2BP2協(xié)同提高KLF12和c-myc的mRNA穩(wěn)定性

由于KLF12和c-myc作為LncRNA-PACERR的下游靶點，推測LncRNA-PACERR是否與IGF2BP2共同調(diào)控KLF12和c-myc的穩(wěn)定性。為了證實這一假設(shè)，首先使用qPCR和western blot分析來闡明LncRNA-PACERR/IGF2BP2對KLF12和c-myc表達(dá)的正向調(diào)控作用（圖8a，b）。放線菌素D發(fā)現(xiàn)，IGF2BP2敲除消除了LncRNA-PACERR過表達(dá)增加的KLF12和c-myc的穩(wěn)定。LncRNA-PACERR敲除通過IGF2BP2過表達(dá)解除了KLF12和c-myc的半衰期（圖8c-f）。為了進(jìn)一步闡明KLF12和c-myc是否被m6A甲基化修飾，使用基于GGAC m6A核心基序的m6A RIP qRT-PCR分析表明，在甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）敲除THP-1細(xì)胞中，KLF12轉(zhuǎn)錄本3'UTR的m6A甲基化和c-myc轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)不穩(wěn)定決定簇（CRD）區(qū)域降低（圖8g）。為了探究LncRNA-PACERR是否影響IGF2BP2與KLF12和c-myc m6a修飾區(qū)域的結(jié)合，通過RIP-qPCR檢測，LncRNA-PACERR敲低顯著降低了IGF2BP2與KLF12和c-myc m6a修飾區(qū)域的結(jié)合（圖8h， i）。鑒于IGF2BP2調(diào)節(jié)的m6A修飾區(qū)域主要位于mRNA 3'UTR的起始點，因此構(gòu)建KLF12 3'UTR的熒光素酶報告載體，然后通過RIP-qPCR驗證野生型報告基因中IGF2BP2和m6A比突變報告基因中富集（圖8j-l）。此外，雙熒光素酶報告分析顯示，LncRNA-PACERR增加了KLF12-3'UTR野生型報告基因中的熒光素酶活性，與IGF2BP2的結(jié)果相似（圖8m）。這些數(shù)據(jù)表明，LncRNA-PACERR與IGF2BP2合作，增強了KLF12和c-myc在TAMs中的穩(wěn)定性。


圖8 LncRNA-PACERR與IGF2BP2以m6a依賴的方式共同調(diào)控KLF12和c-myc


結(jié)論：

LncRNA-PACERR通過兩個途徑促進(jìn)胰腺癌的惡性進(jìn)展:作為ceRNA海綿體的miR-671-3p激活KLF12/ AKT/c-myc通路，并與IGF2BP2相互作用增強KLF12和c-myc的穩(wěn)定性。同時，KLF12轉(zhuǎn)錄的LncRNA-PACERR與KLF12直接相互作用，KLF12/PACERR復(fù)合物通過招募EP300激活LncRNA-PACERR轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)TAMs中的M2極化和腫瘤前功能。