在肺腺癌和鱗狀細胞癌中， CircHMGB2通過miR-181a-5p/CARM1軸驅(qū)動免疫抑制和抗PD-1耐藥性

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要原。非小細胞肺癌(NSCLC)主要包括肺腺癌(LUAD)和鱗狀細胞癌(LUSC)，約占所有肺癌病例的85%。已有研究證實了HMGB2在各種癌癥中的致癌作用，但HMGB2衍生的環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能尚不清楚。本文中，作者研究HMGB2來源的環(huán)狀RNA在肺腺癌(LUAD)和鱗狀細胞癌(LUSC)中的應(yīng)用。本文于2022年5月發(fā)表于《Molecular Cancer》，IF= 10.679。

本文技術(shù)路線：

本文主要內(nèi)容：

1、CircHMGB2在NSCLC患者中的臨床意義

qPCR結(jié)果顯示CircHMGB2是NSCLC組織中表達最顯著的CircRNA (Fig. 1A)。不同引物進行Sanger測序均鑒定出了CircHMGB2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Fig. 1B)。此外，PCR結(jié)果顯示CircHMGB2可以通過不同的引物從cDNA中而不是從gDNA中轉(zhuǎn)錄 (Fig. 1C)。與RNase R共孵育30分鐘后， CircHMGB2對RNase R耐藥，然而HMGB2 mRNA明顯降解(Fig. 1D)。

CircHMGB2在大部分腫瘤組織中高表達，在NSCLC組織中，CircHMGB2表達高于正常組織2倍以上 (Fig. 1E，F)。此外，CircHMGB2的高表達與腫瘤的大尺寸和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān) (Fig. 1G，H)。作者還觀察到CircHMGB2的表達隨著臨床分期的增加而增加(Fig. 1I)。Kaplan-Meier分析顯示，CircHMGB2高表達的患者總生存期(OS)較低，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高(Fig. 1J)

Fig1 CircHMGB2在NSCLC患者中的臨床意義

2、CircHMGB2促進NSCLC增殖，重塑腫瘤微環(huán)境(TME)

CCK-8和集落形成實驗顯示，在NSCLC細胞中，下調(diào)CircHMGB2后細胞增殖下降，CircHMGB2表達升高后細胞增殖增加 (Fig. 2A,B)。此外，對裸鼠皮下植入A549-CircHMGB2和對照細胞進行體外分析發(fā)現(xiàn)過表達CircHMGB2可促進NSCLC的生長 (Fig. 2C, D)。

CCK-8和集落形成實驗顯示，CircHMGB2在LLC細胞中表達上調(diào)后，細胞增殖增加(Fig. 2E，F)。通過皮下注射LLC-CircHMGB2和LLC對照細胞在C57BL/6小鼠體內(nèi)進行了體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)CircHMGB2可以顯著增強免疫活性小鼠皮下腫瘤的生長(Fig. 2G，H)。此外，用流式細胞術(shù)檢測腫瘤的免疫原性。Te結(jié)果顯示在腫瘤來源的LLC CircHMGB2細胞中CD8+ T細胞、NK細胞和NK細胞均存在耗竭(Fig. 2I)。免疫組化染色的CD8+T細胞，CD4+T細胞，NK1.1+ NK細胞，CD68+TAM腫瘤組織中FOXP3+Treg細胞和CD11C+ DCs也有類似趨勢(Fig. 2J)。為了進一步驗證體內(nèi)結(jié)果，在120個NSCLC 組織中進行免疫組化染色也得到相同的結(jié)果。CD8+ T細胞，CD56+ NK細胞和CD11C+ DCs浸潤在CircHMGB2高表達的NSCLC中顯著降低(Fig. 2K)。考慮到CircHMGB2對NSCLC TME的明顯影響，作者推測CircHMGB2主要通過限制TME的抗腫瘤免疫來誘導(dǎo)NSCLC的進展。

Fig2 CircHMGB2促進NSCLC增殖，重塑腫瘤TME

3. CircHMGB2吸附miR?181a?5p上調(diào)CARM1的表達

在H1299細胞中使用CircHMGB2探針進行CircRIP，通過qRT-PCR觀察miR-181a-5p的顯著富集(Fig. 3a)。通過RIP進一步驗證CircHMGB2和miR-181a-5p之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)抗AGO2抗體顯著富集了CircHMGB2和miR-181a-5p (Fig. 3b)。 miR-181a-5p模擬物明顯削弱了野生型CircHMGB2的熒光素酶活性，但沒有削弱突變型CircHMGB2序列的熒光素酶活性(Fig. 3C，D)。miR-181a-5p下拉實驗也顯示CircHMGB2顯著富集(Fig. 3E)。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，在H1299細胞中，敲除CircHMGB2表達后，miR-181a-5p水平升高(Fig. 3F)。在H1299細胞中,FISH染色顯示CircHMGB2和miR-181a-5p在細胞質(zhì)中共定位(Fig. 3G)。預(yù)測CircHMGB2可能通過海綿吸附miR-181a-5p來發(fā)揮其生物學(xué)功能，CARM1為CircHMGB2的下游mRNA，熒光素酶報告實驗表明，與突變體CARM1序列相比，CARM1野生型熒光素酶活性減少 (Fig. 3H，I)。qRT-PCR也顯示在H1299-shCircHMGB2細胞中，CARM1的表達降低(Fig. 3J)， 而在H1299-shCircHMGB2細胞中，敲除miR-181a-5p的表達可顯著恢復(fù)CARM1的表達(Fig. 3K， L)。此外，檢測了120個NSCLC患者中CircHMGB2、miR-181a-5p和CARM1的表達量， miR-181a-5p的表達與CircHMGB2和CARM1水平呈負相關(guān)，而CircHMGB2的表達與CARM1水平呈正相關(guān)(Fig. 3M-O)。在非小細胞肺癌中，CircHMGB2可通過作為miR-181a-5p的海綿， 解除對下游分子CARM1的抑制作用。

Fig3 CircHMGB2通過海綿吸收miR-181a-5p上調(diào)下游分子CARM1的表達

4. 在NSCLC治療中， CircHMGB2限制了PD - 1阻斷

接下來，在CircHMGB2過表達和對照C57BL/6腫瘤小鼠中評估CircHMGB2對抗PD-1治療的潛在影響。當腫瘤大小達到100mm3時，腹腔注射Te PD-1阻斷劑或IgG，劑量為100μg/次，每3 d注射一次 (Fig. 4A)。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，過表達CircHMGB2可顯著降低抗PD-1治療2周后的療效(Fig. 4B， C)。此外，上調(diào)CircHMGB2表達會降低免疫活性小鼠的存活率(Fig. 4D)。作者建立了huHSC-NOGEXL小鼠(Fig.4E)。這些小鼠皮下接種A549-CircHMGB2和A549對照細胞，作者發(fā)現(xiàn)CircHMGB2可以顯著增強人免疫系統(tǒng)小鼠皮下腫瘤的生長(Fig 4F，G)。用流式細胞術(shù)檢測腫瘤的免疫球蛋白,發(fā)現(xiàn)在A549-CircHMGB2細胞來源的皮下腫瘤中存在CD8+ T細胞、NK細胞和DCs耗盡(Fig. 4H)。腫瘤組織中CD8+ T細胞、CD56+ NK細胞和CD11C+ DCs的IHC染色也有類似趨勢(Fig. 4I)。作者在接種A549-CircHMGB2或A549對照細胞的人源小鼠模型上驗證了抗PD -1治療的有效性，并制定了免疫治療的給藥方案(Fig. 4J)。結(jié)果證實CircHMGB2過表達明顯限制了抗PD -1的治療效果(Fig. 4K，L).

Fig 4 CircHMGB2降低PD-1阻斷治療NSCLC的療效

5. 敲除CARM1基因可使CircHMGB2高表達的NSCLC細胞對抗PD - 1抗體治療敏感

鑒于以上結(jié)果顯示CircHMGB2高表達抑制抗PD -1治療NSCLC的療效，作者假設(shè)CircHMGB2失活，CARM1可能增加抗PD-1治療的敏感性。因此，在LLC-CircHMGB2細胞中，用CRISPR-Cas9系統(tǒng)完全敲除CARM1基因(Fig. 5A)。

為了驗證敲除CARM1和PD-1免疫治療的協(xié)同作用，作者通過皮下移植小鼠建立異種移植模型，LLC-CARM1-KO-CircHMGB2和LLC-CARM1-control- CircHMGB2細胞系。結(jié)果顯示，敲除CARM1顯著延緩了抗PD-1后CircHMGB2過表達腫瘤的生長，大大提高了該組小鼠的生存率(Fig. 5B，C)。流式細胞儀分析顯示敲除CARM1后，C57BL/6小鼠皮下CircHMGB2過表達腫瘤，抗PD-1治療可增加CD8+T細胞、NK細胞和DCs的浸潤進入皮下過表達(Fig. 5D)。重要的是，EZM2302 (CARM1的小分子抑制劑)和抗PD-1抗體的應(yīng)用取得了類似的結(jié)果(Fig. 5E-G)。作者在A549細胞中敲除CARM1基因(Fig. 5H)，并建立了A549-CARM1- control-CircHMGB2和A549-CARM1- ko - Circ HMGB2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。然后用A549-CARM1-control-CircHMGB2和A549-CARM1-ko-CircHMGB2細胞建立人源化小鼠皮下腫瘤模型，并給予抗PD-1單抗。體內(nèi)實驗證實，在皮下腫瘤組織中，敲除CARM1顯著延緩了抗PD-1后過表達CircHMGB2引起的腫瘤的生長，促進了CD8+T細胞，T細胞，NK細胞和樹突狀細胞的浸潤。此外，使用EZM2302和anti-PD-1 mAb也取得了相似的效果(Fig. 5K-M)。

體內(nèi)實驗表明，EZM2302處理可增加CD8 +T細胞、NK細胞和DCs細胞的浸潤(Fig.5K-M)，推測EZM2302可能具有協(xié)同抗PD-1的作用改善小鼠腫瘤模型的抗腫瘤反應(yīng)。qRT-PCR檢測病情進展中(PD)，病情穩(wěn)定(SD)，和部分緩解患者(PR)中CircHMGB2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD組CircHMGB2的表達明顯高于PR組和SD組(Fig. 5N)。Spearman分析結(jié)果顯示，CircHMGB2的表達與PD、PR、SD組CARM1陽性表達呈正相關(guān)(Fig. 5O)。此外，免疫組化染色顯示PR和SD組CD8+、T細胞、NK細胞和DCs浸潤明顯高于PD組(Fig. 5P)。24例接受抗PD -1治療的NSCLC患者中，CircHMGB2表達與CARM1表達呈正相關(guān)，與CD8+T細胞、DCs、NK細胞浸潤呈負相關(guān)(Fig. 5Q-S)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，抑制CARM1可以提高CircHMGB2高表達NSCLC患者抗pd -1治療的療效。

Fig5敲除CARM1使CircHMGB2高表達的NSCLC細胞敏感

6、 CircHMGB2通過CARM1抑制1型IFN對NSCLC的響應(yīng)

IFN-γ刺激(5 ng/ml)可上調(diào)IFN激活基因的表達并激活JAK 和STAT1，JAK 和STAT1是參與了1型干擾素反應(yīng)的重要途徑（Fig. 6A）。在Co-IP實驗中，CircHMGB2過表達抑制STAT1去乙?；?/span>CARM1敲除扭轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象(Fig. 6B)。與A549- CircHMGB2或?qū)φ占毎啾龋?/span>CARM1基因敲除的A549細胞，增殖大大受損，而CARM1-KO A549細胞在IFN-γ刺激下凋亡明顯增強 (Fig. 6C， D)。IFN激活 CXCL10、ISG15、IL18、IFIT1、CCL5和IFR7的表達，敲除CARM1后，這些基因的表達顯著增加，過表達CircHMGB2后，這些基因的表達受到抑制(Fig. 6E)。為了進一步驗證CircHMGB2對1型IFN應(yīng)答的調(diào)控作用，作者應(yīng)用IHC技術(shù)檢測了120例NSCLC患者腫瘤組織中STAT1的磷酸化、CARM1的表達以及IFN應(yīng)答基因ISG15和IFIT的表達。結(jié)果表明，CircHMGB2的表達與CARM1的染色呈正相關(guān)，而與STAT1的磷酸化及ISG15、IFIT的表達呈負相關(guān)(Fig. 6F，G)。總之，CircHMGB2通過CARM1抑制1型IFN反應(yīng)，誘導(dǎo)了NSCLC對細胞毒性免疫反應(yīng)的抵抗。

Fig 6 CircHMGB2通過CARM1抑制NSCLC中的1型IFN反應(yīng)

綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)在LUAD和LUSC的腫瘤微環(huán)境中，circHMGB2通過miR - 181a - 5p/CARM1軸驅(qū)動肺腺癌和鱗狀細胞癌中的免疫抑制和抗PD - 1耐藥性，為提高PD-1免疫治療的療效提供了一種新的策略。

參考文獻：

Zhang, L.X., et al., The circular RNA circHMGB2 drives immunosuppression and anti-PD-1 resistance in lung adenocarcinomas and squamous cell carcinomas via the miR-181a-5p/CARM1 axis. Mol Cancer, 2022. 21(1): p. 110.