高分新思路：微生物-腸-心軸調控年齡相關房顫

年齡是房顫（AF）患者增加最重要的因素。腸道微生物異常參與年齡相關疾病。然而，腸道微生物異常是否參與年齡相關AF進展尚未可知。本研究描述了異常腸道菌群在年齡相關性房顫發(fā)病機制中的一種新的因果作用，即異常腸道菌群通過脂多糖（LPS）和葡萄糖（Glu）誘導激活NLRP3炎性小體誘導年齡相關AF。這表明微生物-腸道屏障-心房NLRP3炎癥小體軸可能是治療年齡相關性心律失常的一個合理的分子靶點。本研究于2022年2月發(fā)表在《Cardiovascular Research》IF：10.787期刊上。

技術路線：

主要研究結果

1、年齡改變了腸道菌群組成并促進AF易感性

為確定衰老是否影響大鼠對AF的易感性，分別對老年大鼠(22-24月齡)和幼齡大鼠(2-3月齡)進行心房電生理試驗。與之前的臨床研究結果一致，與幼齡鼠比較，老年大鼠更容易發(fā)生AF（附圖2A-C）。隨后表征了老年鼠和幼齡鼠的糞便微生物組。PCA分析顯示微生物群落結構在PC1和PC2組分均被年齡顯著分離（附圖2D）。在門水平，隨年齡老化，Spirochaetae增加而Verrucomicrobia減少（附圖2E）。與此前研究類似，老年鼠與幼齡鼠的腸道中Firmicutes厚壁菌門與Bacteroidetes擬桿菌門的比例顯著降低，F/B比例，是腸道微生物失衡的一個指標（附圖2F）。這一發(fā)現(xiàn)支持了對AF易感性的增加與衰老過程中腸道失衡的發(fā)展密切相關的觀點。在科水平，老年鼠乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)的豐度較高，而Bacteroidaceae家族成員的豐度在幼齡大鼠中明顯低于老年大鼠（附圖2G）。這種差異可以延伸到屬水平和OUT水平的α-多樣性（附圖2H-I）。這在幼齡鼠和年老大鼠之間顯示的差異模式，表明在衰老過程中腸道微生物群的組成發(fā)生了顯著的變化。

附圖2老化過程改變腸道菌群并促進AF易感性

2、老年鼠微生物組移植增加了幼齡鼠的AF易感性

為了探究腸道微生物組在年齡相關AF中的作用，將老年AF鼠（aged-FMT）或幼齡鼠自身（young-FMT）來源的糞便微生物組移植（FMT）到幼齡鼠，并歲移植6周后的aged-FMT 鼠和young-FMT鼠進行16S測序。PCA顯示兩組微生物組分離（圖1A）。屬水平前15個差異菌群表明受體大鼠腸道菌群已成功向衰老表型轉變（圖1B）。這種改變可以延伸到屬水平和OUT水平的α-多樣性（圖1C）。此外，在門水平上，部分微生物群的變化被aged-FMT 鼠移植給受體鼠（附圖3A）。F/B比例在aged-FMT 鼠也顯著下降（附圖3B）。這些結果表明年齡相關FMT成功改變了幼齡鼠的腸道微生物生態(tài)。此外，aged-FMT 鼠和young-FMT鼠的體重無差別（附圖3C）。

和預期相符，脈沖起搏可誘導aged-FMT 鼠的AF，但沒能引起young-FMT的AF（圖1D，附圖3D）。與young-FMT鼠比較，aged-FMT 鼠有顯著更高的誘導性（圖1E）和更長的AF持續(xù)時間（圖1F），但是兩者間的AERP無差異（附圖3E）。此外，Masson染色顯示aged-FMT 鼠心房纖維化明顯增加（圖1G），心房中纖維化標志物TGF-β1和α-SMA的表達水平明顯升高（附圖3F）。而心室纖維化在二組間無差異（附圖3G and 3H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，年齡相關的微生物失衡導致房顫的易感性增加。

圖1老年鼠腸道微生物組在受體鼠成功重定植并促進其AF易感性

附圖3老年鼠腸道微生物組在受體鼠成功重定植并促進其AF易感性

3、微生物來源LPS的增加隨著老化促進AF

腸道微生物可通過產生活性代謝產物如氧化三甲胺、脂多糖、膽汁酸等來影響宿主生理機能。許多研究表明，循環(huán)LPS水平隨著年齡的增長而升高，并在年齡相關疾病的炎癥過程中發(fā)揮重要作用。因此，作者推測在衰老過程中LPS可能通過介導心房炎癥促進AF。為了確定LPS在年齡相關AF中的作用，作者收集了1152份人類供體血漿樣本進行LPS水平檢測。結果發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，人類供體的血漿LPS濃度逐漸增加（圖2A）。此外，在aged-FMT 鼠中也發(fā)現(xiàn)循環(huán)LPS水平升高（圖2B）。表明LPS可能介導了年齡相關AF的炎癥反應。將LPS拮抗劑LPS-RS用于aged-FMT 鼠，發(fā)現(xiàn)aged-FMT 鼠的房顫誘發(fā)率和房顫持續(xù)時間，纖維化顯著降低（圖2C-F）。表明LPS介導年齡相關AF。

圖2微生物來源LPS的增加隨著老化促進AF

4、老年微生物組移植誘導腸道屏障功能異常

LPS是由革蘭氏陰性菌的外膜囊泡產生，但是本研究中aged-FMT 鼠和young-FMT鼠的糞便中革蘭氏陰性菌的豐度和LPS水平并無差異，提示衰老表型的循環(huán)LPS升高可能與腸道屏障功能障礙有關。因此，作者研究了aged-FMT是否改變了受體鼠腸道屏障的完整性。HE和Masson染色顯示aged-FMT組的結腸近端絨毛長度較短，纖維化面積增加（圖3A-C）。然后，我們用口服FITC檢測腸通透性，現(xiàn)aged-FMT鼠血清FITC水平顯著高于young-FMT鼠（圖3D），提示腸道通透性改變。

為了揭示所觀察到的腸道表型中微生物-上皮間相互作用的機制，作者深入分析了近端結腸組織樣本的蛋白質組。與aged-FMT組相比，在young-FMT組的近端結腸組織樣本中，共發(fā)現(xiàn)179個 (124個上調，55個下調)顯著異常表達蛋白（圖3E和3F）。KEGG分析顯示這些差異蛋白富集至33個通路，主要是炎癥相關通路（圖3G）。這些結果表明，與循環(huán)LPS升高相關的炎癥過程可能參與了增加腸道的通透性，并可通過年齡相關的微生物移植進行功能轉移。

圖3老年微生物組抑制誘導腸道屏障功能異常和病理

5、年齡相關LPS促進房顫通過激活心房NLRP3炎性小體

近來研究報道LPS誘導激活TLR4可作為NLRP3炎性小體的啟動信號。為了探究NLRP3炎性小體是否是年齡相關微生物異常誘導AF的關鍵機制，作者檢測了aged-FMT和young-FMT鼠的NLRP3炎性小體的激活情況。結果顯示凋亡相關蛋白ASC的蛋白表達無變化，而NLRP3，pro-caspase-1，activated caspase-1則在aged-FMT鼠中顯著增加（圖4A）。為驗證NLRP3炎癥小體對老齡相關微生物失衡引起的AF的刺激作用，給aged-FMT鼠使用選擇性炎癥小體抑制劑MCC950來中斷NLRP3-炎癥小體復合物的組裝。結果顯示，與對照組比較，猝發(fā)起搏引起的aged-FMT鼠的AF作用被MCC950顯著抑制，且MCC950還能抑制AF的誘導率和AF持續(xù)時間（圖4B-4D），還發(fā)現(xiàn)aged-FMT+MCC950組鼠表現(xiàn)出更少的心房膠原沉積和膠原體積組分（圖4E）。這些數(shù)據(jù)表明老年大鼠微生物組誘導的NLRP3增強會導致循環(huán)LPS增加最終由于心房纖維化導致AF。

圖4年齡失衡通過激活NLRP3通路促進AF易感性

6、過量葡萄糖協(xié)同LPS增強NLRP3炎性小體活性

NLRP3 炎性體可以響應于結構多樣的損傷相關分子模式而被激活，例如隨著衰老而增加的過量葡萄糖。由于LPS需要其他物質來激活NLRP3炎癥小體，作者推測葡萄糖可能參與了年齡相關性AF的發(fā)展。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)老年大鼠2 h口服糖耐量試驗(OGTT)的結果明顯高于幼年大鼠，糖耐量受損可通過FMT傳遞（圖5A和5B），提示老年微生物群失調導致糖耐量受損。

在體外，使用LPS和高糖處理原代大鼠心肌細胞（CMs）和心肌成纖維細胞（CFs）模擬老年房顫患者的病理內環(huán)境。有趣的是，單獨的 LPS 和 HG 都不能激活 CF 中的 NLRP3 炎癥小體，只有在LPS 和 HG 一起孵育時，才能激活 NLRP3 炎癥小體（圖5C和5D）。然而，LPS和高糖處理CMs對NLRP3炎性小體的表達毫無影響（圖5E和5F）。總之，這些結果表明，高糖是LPS激活心房NLRP3 -炎癥的必要條件，而CF中的TLR4易受LPS和高糖的影響，這可以解釋心房纖維化隨衰老而增強的原因。

圖5 LPS和高葡萄糖可以增強激活NLRP3炎性小體

7、長期健康的幼齡微生物組抑制可抑制老齡大鼠的AF

鑒于 LPS 需要過量的葡萄糖以 TLR4 方式增強 CFs 中 NLRP3 炎癥小體的活性，作者通過使用健康的幼齡微生物群干預，評估微生物群重定殖對老年相關 AF 的潛在治療作用。結果發(fā)現(xiàn)接受young+FMT的處理老年鼠比接受aged+FMT處理的老年鼠有更長的結腸近端絨毛（圖6A and 6B），和更少的纖維化區(qū)域（圖6A and 6C）。隨后發(fā)現(xiàn)上調的血漿LPS（圖6D）在young+FMT受體鼠中均得到恢復。有趣的是，young-FMT顯著降低心房NLRP3 -炎性小體的激活（圖6E）。心房纖維化（圖6F）。此外重定植young+FMT的老年大鼠在誘導AF時失敗了（圖6G-H）。表明長期的young+FMT可以阻止年齡相關的AF通過抑制心房NLRP3炎癥小體活性。

圖6幼齡鼠來源FMT可以抑制AF易感性通過抑制NLRP3炎性小體通路和重塑腸道屏障功能

8、老年臨床患者微生物代謝產物和心房的病理變化

在發(fā)現(xiàn)腸道菌群與老年相關性房顫之間的潛在關系后，進一步在臨床個體中證實這一數(shù)據(jù)。結果表明，無論是與年輕患者還是與年老患者比較，老年AF患者心房樣本中的NLRP3，pro-caspase-1和activated caspase-1的水平均顯著升高（圖7A）。為進一步研究循環(huán)LPS水平與AF患者年齡之間的增量值，據(jù)按年齡四分位數(shù)分層的 LPS 檢查了臨床個體中 AF 的患病率(圖7B)。隨著LPS水平的升高，中老年房顫的患病率呈上升趨勢，但在年輕組不明顯。接下來，收集12012個符合條件的臨床個體的OGTT結果，其中2298人被診斷為2型糖尿病。發(fā)現(xiàn)，響應 OGTT 的血漿葡萄糖水平隨著年齡的增長而連續(xù)上升，直到在 81-90 歲時達到峰值(圖7C)。此外，隨著年齡的增長，血糖峰值出現(xiàn)了延遲，表明衰老延長了葡萄糖負荷時間。此外，響應OGTT的2hG水平也隨著年齡增長而逐漸增加(圖7D)?？傊@些結果闡明了腸道菌群在老年相關性心房纖顫中的作用，并為針對老年相關性心血管疾病的腸道菌群治療策略提供了更多的證據(jù)。

圖7 臨床患者心房及循環(huán)LPS和Glu的病理變化

總之，如圖8，與年齡相關的腸道菌群失調的后果用藍色箭頭表示：失調導致緊密連接蛋白（包括 ZO-1、claudin-4）的表達水平降低，并在腸道中閉塞，從而導致腸道通透性增加 并導致 LPS 轉移到循環(huán)中并可能導致葡萄糖耐量受損。 LPS和過量葡萄糖增強心房NLRP3-炎癥小體活性，導致心房結構因纖維化而重塑。

圖8老年菌群失調導致AF促進的機制模式圖

參考文獻：

Zhang Yun., Zhang Song., Li Bolin., Luo Yingchun., Gong Yongtai., Jin Xuexin., Zhang Jiawei., Zhou Yun., Zhuo Xiaozhen., Wang Zixi., Zhao Xinbo., Han Xuejie., Gao Yunlong., Yu Hui., Liang Desen., Zhao Shiqi., Sun Danghui., Wang Dingyu., Xu Wei., Qu Guangjin., Bo Wanlan., Li Dan., Wu Yue., Li Yue.(2022). Gut microbiota dysbiosis promotes age-related atrial fibrillation by lipopolysaccharide and glucose-induced activation of NLRP3-inflammasome. Cardiovasc Res, 118(3), 785-797. doi:10.1093/cvr/cvab114