香煙煙霧促進(jìn)結(jié)直腸癌的奧秘

吸煙是結(jié)直腸癌（CRC）的主要危險(xiǎn)因素。我們的目的是研究吸煙是否通過改變腸道微生物群和相關(guān)代謝物促進(jìn)CRC。與無煙對照組小鼠相比，暴露于香煙煙霧的小鼠腫瘤發(fā)生率和細(xì)胞增殖顯著增加。在煙霧暴露的小鼠中觀察到腸道微生物失調(diào)，細(xì)菌種類的豐度存在顯著差異，包括Eggerthella lenta的富集，Parabacteroides distasonis 和Lactobacillus spp的耗竭。代謝組學(xué)分析顯示，煙霧暴露小鼠結(jié)腸中的膽汁酸代謝產(chǎn)物增加，尤其是牛去氧膽酸（TDCA）。我們發(fā)現(xiàn)，在煙霧暴露的小鼠中，E.lenta與TDCA的相關(guān)性最大。此外，煙霧暴露小鼠表現(xiàn)出MAPK/ERK信號（TDCA的下游靶點(diǎn)）增強(qiáng)和腸道屏障功能受損。用暴露于煙霧的小鼠（GF-AOMS）的糞便移植的無菌小鼠增加了結(jié)腸細(xì)胞的增殖。同樣，GF-AOMS顯示結(jié)腸上皮中E. lenta和TDCA的豐度增加，MAPK/ERK途徑激活，腸道屏障受損?？傊?，香煙煙霧引起的腸道微生物群失調(diào)在結(jié)腸癌中起致癌作用。煙霧誘導(dǎo)的腸道微生物群失調(diào)改變了腸道代謝物并損害了腸道屏障功能，這激活了結(jié)腸上皮中的MAPK/ERK信號。本文于2022年4月發(fā)表于“Gut”（IF=23.059）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）香煙煙霧促進(jìn)小鼠結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生

為了研究吸煙對結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的影響，我們將AOM處理的C57BL/6小鼠暴露于清潔的空氣或香煙煙霧中（圖1A）。吸煙小鼠的結(jié)腸腫瘤數(shù)量和腫瘤大小均顯著大于無煙對照小鼠（圖1B）。顯微鏡組織學(xué)檢查證實(shí)存在結(jié)腸腺瘤和腺癌（圖1C）。暴露于香煙煙霧顯著增加結(jié)腸腫瘤的發(fā)病率（圖1D）。與無煙對照小鼠相比，暴露于香煙煙霧的小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖增加，表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（圖1E），細(xì)胞增殖蛋白標(biāo)記物增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)水平更高（圖1F）。

2）香煙煙霧調(diào)節(jié)小鼠腸道微生物群

我們對糞便樣本進(jìn)行鳥槍宏基因組測序分析，以確定香煙煙霧暴露引起的腸道微生物群的潛在變化。我們觀察到，與無煙對照組小鼠相比，吸煙組小鼠的α多樣性顯著降低（圖2A）。PCoA分析顯示，煙霧暴露小鼠的腸道菌群聚類明顯不同于無煙對照組小鼠（圖2B）。香煙煙霧暴露小鼠中有20種細(xì)菌顯著改變(圖2C)。其中，E.lenta和Staphylococcus capitis富集，而腸道有益細(xì)菌（包括Lactobacillus reuteri、Parabacteroides distasonis和Bacteroides dorei）則被耗盡。我們通過定量PCR證實(shí)，暴露于香煙煙霧的小鼠中有更高豐度的E. lenta（圖2D）。微生物之間的相互作用可能有助于疾病的進(jìn)展。我們調(diào)查了煙霧暴露小鼠和無煙對照組小鼠之間具有不同豐度的細(xì)菌相互作用的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（圖2E）。我們觀察到，在煙霧暴露的小鼠和無煙對照小鼠之間，細(xì)菌之間的共發(fā)生和共排除相互作用存在顯著差異。我們觀察到E. lenta與兩種益生菌：Lactobacillus jensenii 和 Lactobacillus crispatus之間存在共排相關(guān)性（圖2D），這表明在暴露于香煙煙霧的小鼠中，富集的E. lenta與耗盡的有益菌具有拮抗關(guān)聯(lián)。

3）香煙煙霧改變糞便中腸道微生物群相關(guān)代謝物

我們通過對小鼠糞便進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜（MS）/質(zhì)譜分析，測定煙霧暴露后糞便代謝物的變化。正交偏最小二乘判別分析表明，吸煙小鼠的糞便代謝特征與無煙小鼠有顯著差異（圖3A）。與無煙對照組小鼠相比，香煙煙霧暴露小鼠的糞便中有41種代謝物發(fā)生了改變（圖3B）。改變的代謝物在不同的代謝信號通路中富集或減少(圖3C)。與無煙小鼠相比，吸煙小鼠的膽汁酸生物合成是最豐富的途徑。TDCA是已知的致癌原。煙霧暴露小鼠的TDCA豐度顯著增加（圖3B）。靶向MS進(jìn)一步證實(shí)吸煙小鼠糞便TDCA升高（圖3D）。為了確定微生物群與代謝物的潛在關(guān)聯(lián)，我們通過部分Spearman相關(guān)分析了細(xì)菌與代謝物之間的相關(guān)性。我們觀察到E. lenta與TDCA呈最顯著正相關(guān)，而L. jensenii 和 L. crispatus與TDCA呈負(fù)相關(guān)（圖3E）。我們進(jìn)一步證實(shí)，E. lenta的豐度與糞便中TDCA的濃度呈正相關(guān)（圖3F）。因此，腸道微生物失調(diào)和代謝物改變可能共同促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。

4）香煙煙霧損害腸道屏障功能

為了研究吸煙對腸道屏障功能的影響，我們分析了結(jié)腸緊密連接蛋白claudin-3和ZO-1的表達(dá)水平以及血清脂多糖（LPS）的水平。通過western blot（圖4A）和免疫熒光染色（圖4B），香煙煙霧顯著降低了claudin-3和ZO-1的水平。通過電子顯微鏡檢查進(jìn)一步證實(shí)受損的緊密連接（圖4C）。同時，我們發(fā)現(xiàn)，與無煙小鼠相比，吸煙小鼠的血清LPS水平顯著升高（圖4D）。這些結(jié)果共同表明，吸煙導(dǎo)致腸道屏障功能受損。

5）香煙煙霧增強(qiáng)結(jié)腸上皮中致癌MAPK/ERK通路和促炎途徑

為了獲得吸煙致瘤效應(yīng)的分子見解，我們利用PCR陣列分析了結(jié)腸上皮中癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。與無煙對照小鼠相比，我們在煙霧暴露小鼠中觀察到19個上調(diào)基因和7個下調(diào)基因（圖5A）。富集分析表明，MAPK信號通路是香煙煙霧激活的最主要通路(圖5B)。先前的研究報(bào)道，TDCA可以激活MAPK途徑的ERK亞家族。因此，我們評估了暴露于香煙煙霧的小鼠結(jié)腸上皮中MAPK/ERK的激活情況。吸煙激活MAPK/ERK信號通過磷酸化ERK1/2水平的升高得到證實(shí)（圖5C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，香煙煙霧誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信號通路，促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。

腸道細(xì)菌失調(diào)與炎癥密切相關(guān)。因此，我們利用小鼠炎癥反應(yīng)和自身免疫PCR陣列分析了促炎基因的表達(dá)。與無煙對照組小鼠相比，我們在香煙煙霧暴露小鼠中觀察到27個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因（圖5D）。香煙煙霧可誘導(dǎo)包括IL-17信號和TNF信號通路的改變（圖5E）。RT-PCR證實(shí)，與無煙對照小鼠相比，煙霧暴露小鼠的促炎性Il-17a、Cxcl2表達(dá)增加，抗炎性Il-10表達(dá)減少（圖5F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，吸煙促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生中的炎癥。

6）糞便微生物群移植影響無菌小鼠腸道微生物群

為了證實(shí)香煙煙霧改變的腸道微生物群對結(jié)腸腫瘤發(fā)生的直接作用，我們在無菌小鼠中進(jìn)行了糞便微生物群移植。無菌小鼠灌胃暴露于香煙煙霧或無煙常規(guī)小鼠的糞便。20周后采集小鼠并進(jìn)行檢查（圖6A）。我們進(jìn)行了鳥槍宏基因組測序分析。與傳統(tǒng)的AOM小鼠模型相似，與用無煙小鼠（GF-AOM）糞便灌胃的無菌小鼠相比，用香煙煙霧暴露小鼠（GF-AOMS）糞便灌胃的無菌小鼠的α多樣性顯著降低（圖6B）。β多樣性分析顯示，這兩組無菌小鼠的腸道微生物群明顯分離（圖6C）。進(jìn)一步的分析顯示34種差異豐富的細(xì)菌（圖6D）。在GF-AOMS小鼠中，E. lenta的豐度顯著增加，P. distasonis顯著降低。我們通過定量PCR證實(shí)，GF-AOMS組中的E. lenta豐度顯著高于GF-AOM組（圖6E）。我們進(jìn)一步測試了兩種小鼠模型（無菌小鼠和常規(guī)AOM小鼠）之間微生物群變化的一致性。我們發(fā)現(xiàn)，煙霧暴露AOM小鼠中豐度增加的細(xì)菌在GF-AOMS小鼠中持續(xù)增加，而煙霧暴露AOM小鼠中豐度減少的細(xì)菌在GF-AOMS小鼠中持續(xù)減少（圖6F）。重要的是，我們觀察到在煙霧暴露的AOM小鼠和GF-AOMS小鼠中，E. lenta豐度增加，而P. distasonis豐度降低。相關(guān)分析表明，與供體小鼠相比，無菌小鼠糞便移植后，生態(tài)網(wǎng)絡(luò)模塊保持不變（圖6G）。此外，與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠的糞便TDCA水平也顯著升高（圖6H）。

7）香煙煙霧改變的微生物群增加了無菌小鼠的結(jié)腸細(xì)胞增殖，損害了腸道屏障功能，并增強(qiáng)了MAPK/ERK和促炎基因的表達(dá)

與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖增加，表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞比例更高（圖7A）和PCNA表達(dá)水平更高（圖7B）。接下來，我們研究了香煙煙霧改變的微生物群是否會影響無菌小鼠的腸道屏障功能。我們觀察到GF-AOMS小鼠中claudin-3和ZO-1的表達(dá)降低，血清LPS水平升高（圖7C，D）。電子顯微鏡檢查也證實(shí)了GF-AOMS小鼠的腸道屏障功能受損（圖7E）。為了證實(shí)香煙煙霧改變的微生物群促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們在糞便灌胃無菌小鼠的結(jié)腸上皮上進(jìn)行了癌癥通路檢測陣列。與GF-AOM小鼠相比，我們在GF-AOMS小鼠中發(fā)現(xiàn)了9個上調(diào)基因和3個下調(diào)基因（圖7F）。這些差異表達(dá)基因主要富集在MAPK/ERK信號通路中。與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)升高，證實(shí)了MAPK/ERK信號的激活（圖7G和H）。使用炎癥反應(yīng)和自身免疫PCR陣列，我們發(fā)現(xiàn)與GF-AOM小鼠相比，GF-AOM小鼠中有16個促炎基因上調(diào)（圖7I），并且這些基因也主要富集在TNF和IL-17信號通路中（圖7J）。定量RT-PCR證實(shí)，與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠中TNF和IL-17通路中的關(guān)鍵促炎基因上調(diào)，包括IL-17a和Cxcl2以及Cxcr2（圖7K）。

結(jié)論：這項(xiàng)研究首次證明，吸煙通過誘導(dǎo)腸道微生物群失調(diào)促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。煙霧誘導(dǎo)的腸道微生物群失調(diào)可增加結(jié)腸TDCA水平，進(jìn)而激活結(jié)腸上皮中的MAPK/ERK、IL-17和TNF信號通路。此外，腸道微生物群失調(diào)引起的腸道屏障功能障礙可能進(jìn)一步促進(jìn)TDCA激活MAPK/ERK信號通路。

參考文獻(xiàn)：

Bai X, Wei H, Liu W, Coker OO, Gou H, Liu C, Zhao L, Li C, Zhou Y, Wang G, Kang W, Ng EK, Yu J. Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites. Gut. 2022 Apr 6:gutjnl-2021-325021. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325021.