外泌體來源的CircTRPS1在膀胱癌微環(huán)境中促進(jìn)惡性表型和CD8+ T細(xì)胞衰竭
環(huán)狀RNA (CircRNAs)在不同疾病中發(fā)揮著重要作用。外泌體是細(xì)胞間通訊的重要中間體。雖然兩者在癌癥中都有廣泛報道，但外泌體來源的環(huán)狀RNA很少被研究。本研究中，作者通過高通量測序確定了膀胱癌(BCa)組織和外泌體中不同表達(dá)的環(huán)狀RNA對BCa的影響。本文于2022年3月發(fā)表于《Molecular Therapy》，IF= 8.986。
本文技術(shù)路線：
本文主要內(nèi)容：
1 CircTRPS1在BCa腫瘤和外泌體中作為預(yù)后相關(guān)的上調(diào)CircRNA
作者從4個BCa組織中提取總RNA，并將其與正常組織配對，以識別在BCa中具有重要生物學(xué)功能的環(huán)狀RNA (Fig 1A)。其中CircTRPS1 (hsa_ Circ_0085361)是所有差異表達(dá)CircRNA中差異表達(dá)最顯著的(Fig. 1B)。CircTRPS1的基因組定位為chr 8 nc_000008.11: 115382382 -115，695，751，來源于TRPS1基因(Fig 1C)。放線菌素D處理表明TRPS1的環(huán)狀RNA形式比線性形式更穩(wěn)定(Fig 1D)。核糖核酸酶R降低了BCa細(xì)胞系中線性TRPS1 mRNA的水平，而對CircTRPS1的水平?jīng)]有影響，進(jìn)一步證實了CircTRPS1結(jié)構(gòu)(Fig 1E)。此外，CircTRPS1主要位于細(xì)胞質(zhì)中(Fig 1F)。Kaplan-Meier圖顯示高表達(dá)的CircTRPS1與較低的總生存率相關(guān)(Fig 1G)。有趣的是，CircTRPS1 在BCa腫瘤組織的積累不僅限制在細(xì)胞質(zhì)中，而且在一些細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙觀察到CircTRPS1信號，這表明CircTRPS1在BCa微環(huán)境中聚集在外泌體中發(fā)揮生物功能(Fig 1H)。此外還發(fā)現(xiàn)CircTRPS1在尿源性外泌體中的表達(dá)與BCa的臨床分期呈正相關(guān)(Fig 1I-K)。
Fig1 CircTRPS1在BCa腫瘤和外泌體中作為預(yù)后相關(guān)的CircRNA上調(diào)
2、外泌體來源的CircTRPS1在體外促進(jìn)BCa細(xì)胞的增殖和侵襲
與泌尿上皮細(xì)胞系(SV-HUC-1)比較，CircTRPS1在5種膀胱癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞癌細(xì)胞系(RT4、UM-UC-3、T24、5637、J82)中高表達(dá)(Fig 2A）。CCK-8實驗證實CircTRPS1敲低顯著抑制BCa細(xì)胞的增殖(Fig 2B，C），5-EdU測定得到相似結(jié)果(Fig. 2D)。作者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CircTRPS1敲低后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，這表明si-CircTRPS1對細(xì)胞凋亡有輕微的抑制作用(Fig. 2E)。與SV-HUC-1細(xì)胞相比，BCa細(xì)胞來源的外顯子中CircTRPS1表達(dá)更高(Fig 2F)。電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)外泌體標(biāo)志物TSG101、CD63和CD81(Fig 2H）。此外，作者用PKH67標(biāo)記BCa細(xì)胞來源的外泌體，并將外泌體與癌細(xì)胞孵育。在BCa細(xì)胞中觀察到幾個密集的PKH67，表明外泌體被內(nèi)吞到BCa細(xì)胞中 (Fig 2I)。si- CircTRPS1轉(zhuǎn)染的T24和來自外泌體的UMUC-3細(xì)胞減少了增殖和侵襲(Fig 2J，K)。
Fig2 外泌體來源的CircTRPCircTRPS1作為miR-141-3p的海綿在體外促進(jìn)BCa細(xì)胞的增殖和侵襲
3. CircTRPS1作為miR-141-3p的海綿
AGO2 RIP測定T24細(xì)胞顯示內(nèi)源性的CircTRPS1被富集(Fig 3A)，這表明miRNA可能與CircTRPS1結(jié)合。作者進(jìn)行了miRNA測序，發(fā)現(xiàn)CircTRPS1敲除后差異表達(dá)的miRNA。通過生信分析篩選出miR-23b-3p、miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-125a-5p和miR-125b-5p是與CircTRPS1相關(guān)的潛在miRNAs，在H1299細(xì)胞中使用CircHMGB2探針進(jìn)行CircRIP，通過qRT-PCR觀察miR-181a-5p的顯著富集(Fig 3a)。通過RIP進(jìn)一步驗證CircHMGB2和miR-181a-5p之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)抗AGO2抗體顯著富集了CircHMGB2和miR-181a-5p (Fig 3B)，而這些miRNA均與BCa預(yù)后相關(guān)。通過AGO2 RIP對富集的miRNA進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)miR-141-3p和miR-200a-3p是AGO2-CircTRPS1復(fù)合物中最豐富的miRNA(Fig. 3C)。同樣的，miR-141-3p和miR-200a-3p在CircTRPS1敲低BCa細(xì)胞中上調(diào)(Fig. 3D)。RNA下拉實驗證實CircTRPS1與miR-141-3p的相互作用大于miR-200a-3p(Fig 3E)。作者只檢索到了CircTRPS1與miR-141-3p和miR-200a-3P均有1個預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗證miR-141-3p和miR-200a-3p與CircTRPS1的直接結(jié)合相互作用，作者生成了具有預(yù)測miRNA結(jié)合位點(diǎn)的CircTRPS1片段，并將其插入到雙熒光素酶報告質(zhì)粒中(Fig 3F)。miRNA模擬物導(dǎo)致相對熒光素活性顯著降低，但在CircRNA突變組中只發(fā)現(xiàn)了可以忽略的熒光素活性變化(Fig 3G)。此外，F(xiàn)ISH實驗證實CircTRPS1在細(xì)胞質(zhì)中與miR-141-3p共定位，表明CircTRPS1直接結(jié)合 miR-141-3p(Fig 3H)。此外，miR -141- 3p的相對表達(dá)與CircTRPS1呈負(fù)相關(guān)(Fig 3I)。接下來轉(zhuǎn)染了陰性對照(NC)或CircTRPS1敲低的miR-141-3p 模擬物/抑制劑T24細(xì)胞。CCK8(Fig 3J)和Transwell實驗(Fig 3K)顯示miR-141-3p抑制劑促進(jìn)了BCa細(xì)胞的增殖和侵襲表型，而si-CircTRPS1消除了BCa細(xì)胞的這一生物學(xué)過程。綜上所述，作者的結(jié)果表明CircTRPS1作為miR-141-3p的海綿。
4. CircTRPS1通過調(diào)節(jié)GLS1的表達(dá)改變谷氨酰胺代謝，導(dǎo)致BCa氧化還原平衡失調(diào)
考慮到CircTRPS1敲除后顯著的表型改變，作者使用代謝組學(xué)進(jìn)一步研究sh-CircTRPS1 T24細(xì)胞的代謝功能障礙(Fig 4A)。在sh-CircTRPS1 T24細(xì)胞中，參與TCA循環(huán)的L-谷氨酸、GSH和幾種代謝物下調(diào)(Fig 4A)。GSH代謝、糖異生、谷氨酸代謝和脂肪酸氧化是主要富集的代謝途徑，這表明BCa細(xì)胞存在能量饑餓和氧化還原穩(wěn)態(tài)失調(diào)(Fig 4B)。這些代謝途徑都是谷氨酰胺代謝的下游。接下來從T24和T24 sh-CircTRPS1細(xì)胞的RNA-seq中觀察CircTRPS1相關(guān)代謝功能障礙相關(guān)的關(guān)鍵酶(Fig 4C)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制GLS1在癌細(xì)胞中的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)谷氨酸水平顯著降低，伴隨著GSH和ɑ-KG降低，導(dǎo)致TCA循環(huán)成分減少，糖異生增加(Fig 4D)。同時發(fā)現(xiàn)miR-141-3p和GLS1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (Fig 4E)。雙熒光素酶實驗表明GLS1 mRNA與miR-141-3p直接結(jié)合(Fig4F)。TCGA中BCa患者的基因集富集分析顯示，GLS1差異表達(dá)引起的能量饑餓主要影響mTOR通路(Fig 4G)。谷胱甘肽缺乏會提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而降低細(xì)胞活力，類似于能量饑餓。接下來發(fā)現(xiàn)si-CircTRPS1 T24細(xì)胞中ROS水平顯著升高，與GSH水平下降相關(guān)(Fig 4H)。有趣的是，之前關(guān)于miR-141-3p的研究表明，ROS平衡與其生物學(xué)功能相關(guān)。mir - 1413p抑制劑和GLS1過表達(dá)可以挽救CircTRPS1敲除引起的mTOR和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)通路的抑制作用以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的降低(Fig 4H)，恢復(fù)氧化還原平衡(Fig 4I)。
Fig 4 CircTRPS1通過調(diào)節(jié)GLS1的表達(dá)改變谷氨酰胺代謝，導(dǎo)致BCa氧化還原平衡失調(diào)進(jìn)入翻譯頁面
5. 外泌體來源的CircTRPS1誘導(dǎo)BCa TMEs中的T細(xì)胞衰竭
CD8+ T細(xì)胞是多種免疫調(diào)節(jié)軸的最終執(zhí)行者，也是主要的預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞類型之一。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CircTRPS1在與BCa細(xì)胞的外泌體中是否對CD8 + T細(xì)胞發(fā)揮作用。于是根據(jù)CD8和CircTRPS1的相對表達(dá)水對90名患者分為四組(Fig 5A)。有趣的是，雖然高CD8+ T細(xì)胞浸潤表明BCa預(yù)后較好(Fig 5B)，但CD8+高表達(dá)CircTRPS1地表達(dá)組預(yù)后最好，而CD8+低表達(dá)CircTRPS1高表達(dá)組預(yù)后最差(Fig 5C)。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)用Exo-si-CircTRPS1或BPTES處理時，CD8+ T細(xì)胞中干擾素IFN-g(Fig 5D)、顆粒酶 B (GZMB)(Fig 5E)和穿孔素(Fig 5F)的表達(dá)上調(diào)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，在Exo-si-CircTRPS1或BPTES處理下，CD8+ T細(xì)胞表達(dá)的PD-1減少(Fig 5G)，在BPTES處理下Tim-3的表達(dá)減少(Fig 5H)。此外，與Exo-si-CircTRPS1和BPTES結(jié)合， CD8+ T細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤細(xì)胞毒性(Fig 5I)。
Fig5外泌體來源的CircTRPS1在BCa腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭
6、 沉默外泌體來源的CircTRPS1通過GLS1調(diào)控抑制了BCa在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移
為了進(jìn)一步探索外泌體來源的CircTRPS1在體內(nèi)的作用，建立了T24細(xì)胞形成的腫瘤，每3天靜脈注射20mg外泌體BPTES（Fig. 6A）。發(fā)現(xiàn)BPTES單獨(dú)抑制T24細(xì)胞在體內(nèi)的惡性表型。外泌體si-CircTRPS1顯著降低腫瘤生長速度(Fig. 6B)。與之前的體外實驗結(jié)果一致，免疫組化(IHC)肛門溶解顯示mTOR通路標(biāo)記物(GLS1)，ROS調(diào)控標(biāo)記物(Nrf2)， EMT標(biāo)記物(vimentin和N-cadherin)，細(xì)胞凋亡標(biāo)記物(Bcl-2)和細(xì)胞增殖標(biāo)記物(Ki-67)的表達(dá)在si-CircTRPS1外泌體處理后被抑制，在BPTES處理后進(jìn)一步降低(Fig. 6C)。HE染色顯示，經(jīng)xosome-si- CircTRPS1處理的T24細(xì)胞在肺內(nèi)形成的結(jié)節(jié)較少，BPTES進(jìn)一步抑制了T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力(Fig. 6D，E)，與生物發(fā)光成像一致(Fig. 6F，G)。總之，CircTRPS1相關(guān)的谷氨酰胺代謝重編程在BCa TME中的系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用被提出(Fig. 6H)。
Fig 6 沉默外泌體來源的CircTRPS1可通過GLS1調(diào)控在體內(nèi)抑制BCa的生長和轉(zhuǎn)移
綜上所述，作者的研究通過CircTRPS1/miR-141-3p/GLS1軸證實了CircTRPS1作為腫瘤啟動子的作用。外泌體來源的CircTRPS1可以海綿化miR-141-3p，增強(qiáng)谷氨酰胺代謝中的關(guān)鍵酶GLS1的功能。過表達(dá)GLS1可同時增強(qiáng)BCa細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，削弱BCa微環(huán)境的抗腫瘤免疫功能。因此，作者的研究為BCa提供了新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Yang, C., et al., Exosome-derived circTRPS1 promotes malignant phenotype and CD8+ T cell exhaustion in bladder cancer microenvironments. Mol Ther, 2022. 30(3): p. 1054-1070.