遺傳學(xué)福利——15.88分可變剪接文章搞起來(lái)

肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）一種致命疾病，其特征是異常的可變剪接（AS）。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MN）中剪接因子TDP-43的核丟失和細(xì)胞質(zhì)積累是ALS疾病晚期的標(biāo)志。然而，尚不清楚在TDP-43病理發(fā)生前是否存在改變的AS。本研究利用散發(fā)性和家族性ALS患者的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MNs)，研究了在ALS早期階段的改變AS及其起源。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，ALS中附加的RBP-RNA擾動(dòng)與TDP-43同時(shí)發(fā)生。本研究于2022年6月發(fā)表在《Acta Neuropathologica》IF：15.887期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究?jī)?nèi)容：

1、質(zhì)譜（MS）鑒定ALS中非可溶性候選RNA結(jié)合蛋白（RBP）

TDP-43的不可溶性是ALS的標(biāo)志。利用來(lái)自散發(fā)性ALS（sALS）和家族性ALS（fALS）患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（iPSC-MN）建模，作者首先探究了是否有其他的RBP在ALS iPSC-MN中表現(xiàn)出不溶性增加，分離其不可溶性蛋白組分，用于MS分析（Fig. 1a）。總計(jì)鑒定到88個(gè)蛋白在ALS的不可溶性蛋白組分中富集（Fig. 1b）。當(dāng)樣本標(biāo)簽被隨機(jī)打亂時(shí)，觀察到平均有7.5個(gè)蛋白質(zhì)在相同的統(tǒng)計(jì)閾值上差異富集，這表明存在als特異性蛋白質(zhì)不溶性模式（Fig. 1c）。88個(gè)候選蛋白包括細(xì)胞骨架成分和運(yùn)動(dòng)蛋白，這些功能類別與主要的ALS體外表型相關(guān)（Fig. 1d）。這包括一些突出的蛋白，包括KIF5A，和5個(gè)RBPs：NOVA1，ELAVL4，F(xiàn)XR2，RBFOX2，RBFOX3（Fig. 1d）。有趣的是，不可溶性TDP-43蛋白在ALS組和對(duì)照組間不差異。由于作者主要感興趣的RBP，所以利用WB監(jiān)測(cè)了這5個(gè)候選RBP，結(jié)果顯示不可溶性NOVA1，NOVA2，ELAVL4， RBFOX2，RBFOX3的表達(dá)在ALS組增加（Fig. 1e and f）。而可溶性蛋白NOVA1和NOVA2也增加了?？傊?，作者在ALS-iPSC-MNs中鑒定到5個(gè)豐度增加的非可溶性RBP蛋白。

圖1對(duì)iPSC衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行蛋白分餾，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)RBPs在ALS中溶解度增加

2、NOVA1，NOVA2和RBFOX2和ALS中的可變剪切有關(guān)

NOVA1，NOVA2，RBFOX2和TDP-43是著名的AS調(diào)控因子。為了鑒定它們的RNA結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)每個(gè)RBP在兩個(gè)對(duì)照ALS-iPSC-MNs細(xì)胞系（CV-B和 Ctrl-1-2）進(jìn)行了eCLIP實(shí)驗(yàn)并測(cè)序了IP文庫(kù)（Fig. 2a）。NOVA蛋白主要結(jié)合內(nèi)含子序列，RBFOX2和TDP-43與內(nèi)含子序列和3個(gè)UTR相互作用（Fig. 2b）。不出意外的，同源體NOVA1和NOVA2共享了大量的結(jié)合位點(diǎn)組分，大約93%的NOVA2結(jié)合位點(diǎn)也可與NOVA1結(jié)合（Fig. 2c上）。有趣的是，RBFOX2中超過(guò)10%的位點(diǎn)和TDP-43共享（Fig. 2c上）。在基因轉(zhuǎn)錄水平上，約60%的TDP-43靶點(diǎn)也是NOVA1的靶點(diǎn)（Fig. 2c下）。K-mer分析為TDP-43（Fig. 2d），NOVA（Fig. 2e and f）和RBFOX2（Fig. 2g）檢索到可重復(fù)的、已知的和高度富集的序列motif。因此，iPSC-MNs中對(duì)NOVA1、NOVA2、RBFOX2和TDP-43的eCLIP分析明確揭示了它們?cè)诨騾^(qū)域和序列motif水平上已知的結(jié)合偏好。

為了將這些RBP的結(jié)合位點(diǎn)與AS變化聯(lián)系起來(lái)，生成了相應(yīng)的配對(duì)端RNA-seq數(shù)據(jù)集。集中分析在上游外顯子和下游外顯子所包含的pre-mRNA 區(qū)域，觀察到相對(duì)于Ctrl，NOVA1、NOVA2 和 RBFOX2 結(jié)合位點(diǎn)在sALS（Fig. 2h）和 fALS（Fig. 2i）盒式外顯子處的AS顯著富集。與TDP-43相比，這三種蛋白富集的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義一致更高（Fig. 2h and i）。引人注目的是，與本研究的數(shù)據(jù)集相似，在AnswerALS聯(lián)盟的這些數(shù)據(jù)集中，ALS和Ctrl之間的盒式外顯子AS中，NOVA1、NOVA2和RBFOX2結(jié)合位點(diǎn)也在統(tǒng)計(jì)上豐富（Fig. 2j and k）。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，作者進(jìn)行了RNA測(cè)序和AS分析，并鑒定到277個(gè)顯著的AS事件，且在兩個(gè)eCLIP重復(fù)之一的SPG11-HSP中，RBFOX2結(jié)合也在AS中顯著富集（Fig. 2l）。總之，NOVA1、NOVA2和RBFOX2的結(jié)合與ALS中差異調(diào)控的AS事件密切相關(guān)，并且NOVA1和NOVA2在ALS中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的富集。

圖2 NOVA1、NOVA2和RBFOX2的結(jié)合與ALS中差異調(diào)節(jié)的AS事件相關(guān)

3、NOVA1在ALS iPSC-MNs中增加，而在TDP-43細(xì)胞質(zhì)定位的小鼠和化學(xué)壓力的iPSC-MNs中減少

NOVA蛋白是神經(jīng)元富集的AS因子。NOVA1敲低小鼠是出生后致死的由于進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能障礙伴脊髓細(xì)胞死亡增加。小鼠的表達(dá)分析表明，Nova1和Nova2的表達(dá)模式是相互的，其中，Nova2主要表達(dá)在皮層和海馬，而更高水平的Nova1在中腦和脊髓中觀察到。Nova1與脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生物學(xué)之間的緊密聯(lián)系，使作者專注于Nova1在人類MNs中的關(guān)聯(lián)及其在ALS中的功能改變。

作者觀察到sALS iPSC-MN中NOVA1 mRNA水平顯著升高（Fig. 3a），在fALS樣本中，NOVA1 mRNA水平也明顯升高（Fig. 3b）。在 sALS-AA 數(shù)據(jù)集中也觀察到 NOVA1 水平的增加（圖 3c），而 C9-ALS-AA 的增加趨勢(shì)未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3d）。這種NOVA1 mRNA在ALS中的增加也反映在蛋白質(zhì)水平上（Fig. 3e and f）。接下來(lái)，探究TDP-43功能，特別是功能喪失或細(xì)胞質(zhì)毒性功能獲得是否與NOVA1 mRNA水平的改變相關(guān)。分析了3個(gè)常用的TDP-43敲低的RNA-seq數(shù)據(jù)集，沒有發(fā)現(xiàn)NOVA1 mRNA水平的變化（Fig. 3g–i）。然而，在缺乏核定位信號(hào)的TDP-43過(guò)表達(dá)的小鼠模型中，NOVA1 mRNA水平顯著降低（Fig. 3j）。在iPSC-MN中應(yīng)用化學(xué)應(yīng)激源嘌呤霉素(puromycin)，其可抑制蛋白質(zhì)翻譯，并促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)TDP-43積累，也可導(dǎo)致NOVA1水平的降低（Fig. 3k）。這些結(jié)果表明在ALS iPSC-MN中，NOVA1表達(dá)增加，細(xì)胞質(zhì)TDP-43水平升高與NOVA1 mRNA水平降低相關(guān)。

圖3在ALS iPSC-MN中，NOVA1表達(dá)增加，細(xì)胞質(zhì)TDP-43水平升高與NOVA1 mRNA水平降低相關(guān)

4、ALS iPSC來(lái)源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表現(xiàn)出異常的NOVA1功能

為了理解NOVA1如何影響MN的AS，構(gòu)建了NOVA1敲低和過(guò)表達(dá)模型（Fig. 4a-c）。生成RNA-seq數(shù)據(jù)集后對(duì)差異AS事件進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果顯示NOVA1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致AS事件增多（n=3046），敲低NOVA1導(dǎo)致AS改變減少（n=174），其中35個(gè)AS事件在兩者間共享（Fig. 4d）。正如預(yù)期的那樣，在NOVA1過(guò)表達(dá)（Fig. 4e）和敲低（Fig. 4f）條件下，NOVA1結(jié)合位點(diǎn)在不同AS事件中富集。由于NOVA同源蛋白共享結(jié)合位點(diǎn)(圖2c)，所以NOVA2的結(jié)合位點(diǎn)也在AS位點(diǎn)富集也就不意外了（Fig. 4e and f）。為了了解NOVA1對(duì)AS的位置依賴效應(yīng)，確定了在AS事件周圍特定位置的NOVA1結(jié)合位點(diǎn)富集，并包括了AS變化的方向性（Fig. 4g）。雖然在NOVA1過(guò)表達(dá)時(shí)被排除的外顯子在選擇性外顯子中富集了NOVA1結(jié)合位點(diǎn)，但獲得NOVA1功能時(shí)包含的外顯子在上游和下游內(nèi)含子中富集了NOVA1結(jié)合位點(diǎn)（Fig. 4h）。當(dāng)NOVA1敲除時(shí)AS事件中的NOVA1結(jié)合模式發(fā)生了相反的變化（Fig. 4i）。這些數(shù)據(jù)表明，NOVA1與選擇性外顯子結(jié)合促進(jìn)其排除，與下游內(nèi)含子結(jié)合提高外顯子包含水平。相反，與上游內(nèi)含子結(jié)合可能會(huì)對(duì)備選外顯子產(chǎn)生距離依賴的影響，近端與遠(yuǎn)端結(jié)合分別介導(dǎo)排斥或包含（Fig. 4j）。

圖4在人類iPSC運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，NOVA1以位置依賴的方式介導(dǎo)AS

為確定NOVA1在ALS中的確切作用模式，采用無(wú)監(jiān)督k-means聚類，使用 7,282 個(gè) AS 事件的包含水平差異顯著改變了 4 個(gè) ALS 數(shù)據(jù)集中至少一個(gè)數(shù)據(jù)集的AS事件。應(yīng)用了兩個(gè)NOVA1數(shù)據(jù)集和互補(bǔ)的SPG11-HSP數(shù)據(jù)集。此外，整合了從NOVA1的位置依賴AS分析中獲得的信息（Fig. 5a）?？偣搏@得了8個(gè)集群(0-7)分組AS事件，它們?cè)?次ALS比較中至少有一次發(fā)生變化（Fig. 5b）。其中，簇0在所有4個(gè)ALS數(shù)據(jù)集和NOVA1敲除條件下顯示外顯子不存在，但在NOVA1過(guò)表達(dá)iPSC-MN中包含（Fig. 5c）。SPG11-HSP患者在cluster 0 AS事件中沒有表現(xiàn)出改變（Fig. 5c）。整合本研究的 eCLIP-seq 數(shù)據(jù)后，檢測(cè)到簇 1、2、3、4 和 5 中 NOVA1 結(jié)合富集的顯著性較低（Fig. 5d and e）。 簇 7 表現(xiàn)出與替代外顯子的強(qiáng)結(jié)合（Fig. 5d and e，棕色條），但改變 NOVA1 水平后的變化是中等的，表明這些事件可能受 NOVA1 影響，但不能僅通過(guò)改變 NOVA1 水平來(lái)改變。簇 6 的變化伴隨著 NOVA1 與上游內(nèi)含子結(jié)合的強(qiáng)烈富集（Fig. 5d and e，黃色條），表明該簇受 NOVA1 的影響，受混合的、患者特異性的方向性模式影響。有趣的是，簇0顯示出NOVA1與上游內(nèi)含子的強(qiáng)結(jié)合（Fig. 5d and e，粉紅色條，箭頭）。結(jié)合觀察到的AS的變化(圖5c)，聚類0代表ALS特異性的NOVA1功能缺失特征。

圖5 ALS中異常的NOVA1狀態(tài)表現(xiàn)出功能獲得和功能喪失的特征

5、在ALS死后組織MN中，NOVA1的表達(dá)隨疾病狀態(tài)而動(dòng)態(tài)變化

iPSC衍生模型代表了疾病的早期階段。為了研究ALS早期階段NOVA1細(xì)胞表達(dá)模式的組織病理學(xué)改變，對(duì)死后脊髓切片進(jìn)行了神經(jīng)病理學(xué)分析。對(duì)9例sALS和7例Ctrls脊髓MN的TDP-43病理進(jìn)行了分類然后檢測(cè)NOVA1的表達(dá)模式（Fig. 6a）。sALS中TDP-43核丟失的MNs數(shù)量各不相同。Ctrl MNs未觀察到TDP-43的核丟失。有趣的是，絕大多數(shù)具有TDP-43核保留的sALS MNs并沒有表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)TDP-43的積累。因此，在進(jìn)一步的分析中只考慮TDP-43的核存在（Fig. 6b，紫色箭頭）和核丟失（Fig. 6b，紅色箭頭）作為將sALS MNs分為兩類的指標(biāo)。隨著核TDP-43的丟失，MNs的核NOVA1水平顯著降低（Fig. 6c）。核TDP-43存在的MNs細(xì)胞質(zhì)NOVA1明顯增加（Fig. 6d）。為了研究這些變化與生理表達(dá)模式的比較，還分析了Ctrl樣本中的MNs（Fig. 6e）。關(guān)于NOVA1的表達(dá)，核保留TDP-43的sALS MNs顯示NOVA1核正常表達(dá)，而TDP-43核丟失的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)NOVA1信號(hào)顯著增加（Fig. 6f）。觀察到具有低 STMN2 表達(dá)的運(yùn)動(dòng)皮層樣本中 NOVA1 表達(dá)顯著降低（Fig. 6i），并且在來(lái)自 sALS 的激光捕獲的 MN 數(shù)據(jù)集中有類似的趨勢(shì)（Fig. 6h），與此前的觀察結(jié)果一致即NOVA1 水平在 TDP-43表達(dá)缺乏其核定位信號(hào)時(shí)和化學(xué)應(yīng)激源的應(yīng)用時(shí)顯著降低（Fig. 3j and k）。

圖6 ALS和Ctrl患者腰脊髓死后MN中NOVA1的表達(dá)

總之，本研究使用質(zhì)譜鑒定到88個(gè)候選蛋白在ALS 患者衍生的 iPSC-MN 不溶性組分中富集，包括RBPs：NOVA1、NOVA2、ELAVL4、RBFOX2 和 RBFOX3。使用 eCLIP 分析，確定了 NOVA1、NOVA2 和 RBFOX2 在 ALS 中可變剪接的盒式外顯子處的富集結(jié)合。相反，在非 ALS 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病隊(duì)列中，NOVA 蛋白在 AS 位點(diǎn)的富集程度較低。整合 NOVA1 過(guò)表達(dá)和敲除的RNA-seq數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)NOVA1 的 AS功能在 ALS 中被破壞，包括 NOVA1 功能特征的持續(xù)丟失。在細(xì)胞水平上，檢測(cè)到ALS 中蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。在 ALS 患者的死后脊髓組織中，NOVA1 的表達(dá)模式是階段依賴性的，在尚未表現(xiàn)出 TDP-43 病理學(xué)的 MNs中已經(jīng)存在升高的細(xì)胞質(zhì) NOVA1 水平。NOVA1 改變的細(xì)胞和功能特性是 ALS 的分子發(fā)病機(jī)制的特征，先于該疾病的神經(jīng)病理學(xué)特征（Fig. 7）。

圖7 通過(guò)TDP-43病理學(xué)確定ALS病程早期和晚期的NOVA1病理改變和功能異常的模式圖。NOVA1細(xì)胞和功能特性的改變?cè)?/span>ALS早期特別存在。

參考文獻(xiàn)：

Krach Florian., Wheeler Emily C., Regensburger Martin., Boerstler Tom., Wend Holger., Vu Anthony Q., Wang Ruth., Reischl Stephanie., Boldt Karsten., Batra Ranjan., Aigner Stefan., Ravits John., Winkler Juergen., Yeo Gene W., Winner Beate.(2022). Aberrant NOVA1 function disrupts alternative splicing in early stages of amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol, undefined (undefined), undefined. doi:10.1007/s00401-022-02450-3