DNMT1-PAS1-PH20軸驅(qū)動(dòng)乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

PH20是人類透明質(zhì)酸酶家族的成員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸并控制腫瘤進(jìn)展。抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)導(dǎo)致透明質(zhì)酸水平升高。然而，DNMT抑制劑是否能控制PH20仍不清楚。在這里，我們報(bào)道DNMT1抑制劑地西他濱通過(guò)激活lncRNA PHACTR2-AS1 (PAS1)來(lái)抑制PH20的表達(dá)。PAS1與RNA結(jié)合蛋白vigilin和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1形成一個(gè)三部復(fù)合體。PAS1與vigilin的相互作用維持了PAS1的穩(wěn)定性。同時(shí)，PAS1招募SUV39H1觸發(fā)PH20的H3K9甲基化，導(dǎo)致其沉默。在功能上，PAS1通過(guò)抑制PH20，至少部分抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。地西他濱與直接結(jié)合SUV39H1的PAS1-30nt-RNA聯(lián)合治療可有效阻斷小鼠乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。總之，DNMT1、PAS1和PH20組成了一個(gè)控制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的調(diào)控軸。這些發(fā)現(xiàn)表明DNMT1-PAS1-PH20軸是乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。本文于2022年3月發(fā)表于Signal Transduction and Targeted Therapy（IF= 18.187）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）DNMT1是調(diào)控PAS1的關(guān)鍵基因

為了了解PAS1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，將靶向183個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的siRNAs轉(zhuǎn)染到MCF7細(xì)胞中，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)PAS1的倍數(shù)變化。我們發(fā)現(xiàn)，32個(gè)TF siRNA導(dǎo)致PAS1的激活，而18個(gè)TF siRNA導(dǎo)致PAS1的抑制(圖1a)。鑒于PAS1在乳腺癌中的抑制作用，我們重點(diǎn)研究了17個(gè)參與RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控的基因。在這些基因中，發(fā)現(xiàn)13個(gè)siRNA上調(diào)PAS1，這13個(gè)基因可以抑制PAS1的轉(zhuǎn)錄(圖1b)。此外，oncomine數(shù)據(jù)集分析顯示，乳腺癌組織中13個(gè)基因中有5個(gè)基因的mRNA表達(dá)高于正常乳腺組織，包括NR6A1、DNMT1、HDAC1、FOXM1和EZH2(圖1c)。我們通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了它們?cè)谌橄侔┘?xì)胞株中的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)DNMT1基因下調(diào)后PAS1明顯上調(diào)(圖1d)。因此，我們認(rèn)為DNMT1是調(diào)控PAS1的關(guān)鍵基因。

2）DNMT1抑制PAS1的表達(dá)

為了探討DNMT1與PAS1表達(dá)的關(guān)系，我們首先通過(guò)RNA原位雜交檢測(cè)PAS1 RNA水平，并通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)人乳腺癌組織陣列DNMT1蛋白水平。DNMT1的表達(dá)與PAS1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖2a, b)。為了驗(yàn)證DNMT1對(duì)PAS1的調(diào)控作用，我們檢測(cè)了DNMT1敲低或過(guò)表達(dá)時(shí)PAS1的水平。DNMT1敲低導(dǎo)致PAS1表達(dá)上調(diào)(圖2c)，而DNMT1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致PAS1 RNA水平降低(圖2d)。為了進(jìn)一步了解DNMT1對(duì)PAS1的調(diào)控作用，我們觀察了DNMT1在PAS1啟動(dòng)子上的占據(jù)情況，發(fā)現(xiàn)DNMT1可以與PAS1啟動(dòng)子結(jié)合(圖2e)。綜上所述， PAS1的轉(zhuǎn)錄受到DNMT1的負(fù)調(diào)控。

3）Vigilin通過(guò)與PAS1相互作用增強(qiáng)PAS1的穩(wěn)定性

為了確定PAS1的相互作用體，我們采用RNA拉下結(jié)合質(zhì)譜的方法。發(fā)現(xiàn)了四種候選蛋白，包括vigilin，matrin-3，SFPQ和hnRPQ(圖3a)。為了驗(yàn)證這些候選蛋白，我們進(jìn)行了RNA pull-down結(jié)合western blot分析。結(jié)果顯示，最明顯和特異性的PAS1互作蛋白是vigilin (圖3b)。然后，我們構(gòu)建了三個(gè)PAS1截?cái)嗤蛔凅w，發(fā)現(xiàn)從1301到2134的核苷酸C末端足以與vigilin結(jié)合(圖3c)。然后使用RIP在體內(nèi)檢測(cè)PAS1和vigilin之間的相互作用。如預(yù)期的那樣，抗vigilin抗體在MCF7細(xì)胞中沉淀內(nèi)源性PAS1(圖3d)。此外，我們通過(guò)RNA FISH和免疫熒光染色觀察到PAS1和vigilin在Hs578T細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖3e)。鑒于vigilin在維持mRNA穩(wěn)定性方面的作用，我們推測(cè)vigilin影響PAS1的穩(wěn)定性。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們首先檢測(cè)了vigilin對(duì)PAS1水平的影響，發(fā)現(xiàn)vigilin的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中PAS1的增加(圖3f)。然后用轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD處理Hs578T細(xì)胞，檢測(cè)PAS1的半衰期。結(jié)果表明，PAS1在對(duì)照細(xì)胞中的半衰期約為4 h。vigilin過(guò)表達(dá)后，PAS1的半衰期延長(zhǎng)至8 h(圖3g)。這些數(shù)據(jù)表明，PAS1與vigilin相互作用，維持其穩(wěn)定性。

4）PAS1下調(diào)PH20的表達(dá)

為了探索PAS1的靶基因，我們對(duì)PAS1進(jìn)行了共表達(dá)分析。我們從GEO數(shù)據(jù)集中下載了100個(gè)包含PAS1 Affy-probe的基因表達(dá)譜。P值最小的前10個(gè)基因如圖4a所示。在這10個(gè)基因中，SPAM1(又稱PH-20)具有水解酶活性。PH20的異常表達(dá)已在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)，并與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，我們選擇PH20作為PAS1的候選靶點(diǎn)。我們首先估計(jì)了有或沒(méi)有PAS1過(guò)表達(dá)的PH20水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)PAS1抑制了PH20的表達(dá)(圖4b)。而PAS1敲除恢復(fù)了PH20的表達(dá)，表明PAS1對(duì)PH20的負(fù)調(diào)控(圖4c)?？紤]到DNMT1對(duì)PAS1的抑制作用，我們進(jìn)一步估計(jì)DNMT1對(duì)PH20水平的影響。DNMT1敲低導(dǎo)致PH20表達(dá)下降(圖4d)。

由于PAS1直接與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1結(jié)合，而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1也與vigilin相互作用，這三個(gè)分子可能形成復(fù)合物。為了測(cè)試這個(gè)想法，我們進(jìn)行了RIP和Co-IP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SUV39H1可以免疫沉淀PAS1和vigilin (圖4 e, f)。接下來(lái)，RNA下拉顯示生物素標(biāo)記的PAS1 RNA可以同時(shí)與SUV39H1和vigilin結(jié)合(圖4 g)。由于SUV39H1催化的H3K9二甲基化和三甲基化(H3K9me2和H3K9me3)介導(dǎo)基因沉默，SUV39H1可能參與抑制PAS1對(duì)PH20的作用。事實(shí)上，SUV39H1基因敲除增強(qiáng)了PH20的表達(dá)(圖4h)。H3K9me2和H3K9me3都富集在PH20啟動(dòng)子中(圖4i)。PAS1的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了H3K9me3的占據(jù)(圖4j)，提示H3K9me3參與了PAS1對(duì)PH20的抑制。這些數(shù)據(jù)表明，PAS1通過(guò)與SUV39H1相互作用，促進(jìn)了H3K9me3在PH20啟動(dòng)子上的占據(jù)，導(dǎo)致了PH20的抑制。

5）PAS1通過(guò)PH20部分抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

攜帶PAS1的慢病毒降低了患有多發(fā)性腫瘤的PyMT小鼠的腫瘤體積，并減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量(圖5a, b)。通過(guò)組織學(xué)染色證實(shí)了肺轉(zhuǎn)移(圖5c)。接下來(lái)，通過(guò)傷口愈合和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PAS1抑制癌細(xì)胞遷移的作用。抑制PAS1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移。但同時(shí)敲除PH20后，創(chuàng)面愈合速度和細(xì)胞遷移速度恢復(fù)到對(duì)照組細(xì)胞的水平(圖5d-h)，說(shuō)明PH20參與了PAS1對(duì)癌細(xì)胞遷移的抑制。

6）PAS1-30nt-RNA和DNMT抑制劑的聯(lián)合抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

DNMT是很有前途的治療靶點(diǎn)，一些DNMT抑制劑，如地西他濱，已被用于治療癌癥?；谏鲜?/span>DNMT1敲除對(duì)PAS1和PH20的影響，我們?cè)u(píng)估了地西他濱在乳腺癌細(xì)胞中的作用。一致地，地西他濱可導(dǎo)致PAS1水平升高，PH20水平降低(圖6a, b)。一些研究已經(jīng)證實(shí)，DNMT抑制劑與其他藥物聯(lián)合使用似乎比單一藥物更有效。PAS1-30nt-RNA是一個(gè)合成的PAS1片段，用于體內(nèi)RNA傳遞。因此，我們用異種移植小鼠觀察單獨(dú)地西他濱、單獨(dú)PAS1-30nt-RNA或聯(lián)合PAS1-30nt-RNA在體內(nèi)是否可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。PAS1-30nt-RNA與地西他濱聯(lián)合抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果優(yōu)于單獨(dú)地西他濱或單獨(dú)使用PAS1-30nt-RNA(圖6c, d)。接下來(lái)，我們觀察地西他濱和PAS1-30nt-RNA對(duì)轉(zhuǎn)移性小鼠模型的治療效果。正如預(yù)期的那樣，聯(lián)合組的轉(zhuǎn)移信號(hào)比單獨(dú)地西他濱或單獨(dú)PAS1-30nt-RNA組的轉(zhuǎn)移信號(hào)要少(圖6e, f)。這些結(jié)果提示地西他濱聯(lián)合PAS1-30ntRNA對(duì)抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有一定的治療價(jià)值。

結(jié)論：我們報(bào)道DNMT1抑制劑通過(guò)激活PAS1來(lái)控制PH20的表達(dá)。DNMT抑制劑地西他濱與PAS1-30nt-RNA聯(lián)合治療可有效阻斷乳腺腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

Fu Y, Zhang X, Liu X, Wang P, Chu W, Zhao W, Wang Y, Zhou G, Yu Y, Zhang H. The DNMT1-PAS1-PH20 axis drives breast cancer growth and metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2022 Mar 21;7(1):81. doi: 10.1038/s41392-022-00896-1. PMID: 35307730; PMCID: PMC8934873.