線粒體融合/裂變干預(yù)——特異性心臟病藥物作者發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶組裝因子4（SDHAF4）在心肌和人類患者的病變心臟中在病理應(yīng)激反應(yīng)中下調(diào)，并證實(shí)心臟SDHAF4介導(dǎo)
琥珀酸脫氫酶被稱為線粒體復(fù)合體II，因其在線粒體功能中的獨(dú)特作用而吸引了人們對(duì)其參與人類疾病研究的興趣。在此，作者發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶組裝因子4（SDHAF4）在心肌和人類患者的病變心臟中在病理應(yīng)激反應(yīng)中下調(diào)，并證實(shí)心臟SDHAF4介導(dǎo)的線粒體復(fù)合體II組裝中斷能促進(jìn)擴(kuò)張型心肌病進(jìn)展。本研究于2022年6月發(fā)表雜《NATURE COMMUNICATIONS》IF：17.694。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、人中SDHAF4異常表達(dá)以響應(yīng)心臟損傷和心臟病變
心臟是線粒體含量較高的器官之一，心肌的功能主要依賴于線粒體的穩(wěn)態(tài)。作者猜想SDHAFs可能參與了調(diào)控心臟功能。檢測(cè)了心肌梗死（MI）小鼠模型心臟組織中的4個(gè)SDH組裝因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有SDHAF4的mRNA和蛋白表達(dá)（Fig. 1a-1d）在MI建模后顯著下調(diào)。免疫熒光揭示SDHAF4與線粒體的初步共定位（Fig. 1e）。在酵母中SDHAF4可以促進(jìn)SDHA與SDHB的組裝。值得注意的是，MI手術(shù)后SDHA和SDHB之間的相互作用降低，提示SDHAF4在MI小鼠中起一定的下調(diào)作用（Fig. 1f, g）。在GSE135055數(shù)據(jù)中，SDHAF4在心臟中的表達(dá)下降與人類心臟疾病密切相關(guān)，包括DCM（擴(kuò)張型心肌?。┖蚆CD（微血管冠脈疾病）。綜上所述，這些結(jié)果表明SDHAF4表達(dá)對(duì)心臟損傷非常敏感。作者推測(cè)SDHAF4可能是參與調(diào)節(jié)心臟穩(wěn)態(tài)的復(fù)合物II的獨(dú)特因子。
圖1 SDHAF4的表達(dá)在MI小鼠中下調(diào)
2、心臟SDHAF4缺失導(dǎo)致心臟缺陷并降低新生兒存活能力
通過構(gòu)建 Sdhaf4 的 floxed 等位基因（Sdhaf4fl）并隨后生成 Ckmm-Cre 轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)心臟和骨骼肌中 Sdhaf4 失活的小鼠，以檢測(cè)SDHAF4 在心臟中的作用。該突變小鼠命名為Sdhaf4 fl/fl,Ckmm-Cre或Sdhaf4 Ckmm。Sdhaf4 Ckmm小鼠的存活力顯著降低，沒有一只突變鼠存活超過12周（Fig. 2a）。Sdhaf4 Ckmm小鼠的心臟明顯增大，提示突變鼠心臟缺陷。心電圖結(jié)果顯示和對(duì)照組比較，Sdhaf4 Ckmm小鼠的FS%和EF%都顯著下降（Fig. 2c–f），表明Sdhaf4丟失損害心臟功能。
隨后將Sdhaf4-floxed 等位基因小鼠和三苯氧胺誘導(dǎo)的Myh6-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（Mer-CreMer）雜交以進(jìn)一步驗(yàn)證SDHAF4缺失對(duì)心臟表型的影響。三苯氧胺處理完善了Cre重組酶介導(dǎo)的小鼠心肌組織中SDHAF4的特異性缺失（Fig. 2g）。三苯氧胺誘導(dǎo)8周后，純合小鼠（Sdhaf4 fl/fl,Mer-CreMer，Sdhaf4 Mer-CreMer）的存活力顯著下降，且心臟顯著增大（Fig. 2h, i）。綜上，這些結(jié)果表明SDHAF4缺失導(dǎo)致心臟和致命性異常，這表明Sdhaf4是心臟的一個(gè)必需基因。
圖2心臟敲除SDHAF4后導(dǎo)致心力衰竭縮短小鼠壽命
3、心臟敲除SDHAF4后誘發(fā)擴(kuò)張型心肌病
接下來作者分析了心臟在不同階段的總體形態(tài)學(xué)以監(jiān)測(cè)Sdhaf4 Ckmm小鼠的病理過程。在出生后的前6周，Sdhaf4 Ckmm小鼠的體重和它們同窩出生的WT小鼠的體重相似（Fig. 3a），但是心臟重量在3周的時(shí)候逐漸增加（Fig. 3b）。HE染色觀察到最后階段的心室組織發(fā)生擴(kuò)張，表明Sdhaf4缺失導(dǎo)致心臟重塑和DCM進(jìn)展（Fig. 3c）。Masson染色顯示在最初4周內(nèi)，Sdhaf4 Ckmm小鼠的心臟纖維化無明顯改變，但是在后后7周出現(xiàn)明顯的膠原沉積（Fig. 3d）。一致的，心肌病標(biāo)記基因（胎兒基因）的表達(dá)在Sdhaf4 Ckmm小鼠4周齡時(shí)開始上調(diào)（Fig. 3e）。心肌病標(biāo)記基因表達(dá)上調(diào)在三苯氧胺誘導(dǎo)的Sdhaf4 Mer-CreMer小鼠中也觀察到了（Fig. 3f）。這些結(jié)果表明，心臟中Sdhaf4的缺失引發(fā)了心臟發(fā)病機(jī)制。
圖3心臟敲除SDHAF4后誘發(fā)擴(kuò)張型心肌病
4、阻斷復(fù)合體Ⅱ的組裝導(dǎo)致線粒體功能異常
SDHAF4被證明與催化SDHA亞基特異性相互作用，并促進(jìn)其與SDHB的結(jié)合，進(jìn)而組裝SDH復(fù)合物。所以作者檢測(cè)了SDH復(fù)合物在小鼠心臟中不同時(shí)期的表達(dá)水平。SDHAF4的表達(dá)和其它SDH復(fù)合物亞基的表達(dá)在產(chǎn)后發(fā)育中逐漸增加（Fig. 4a）。在出生后3周齡時(shí)SDHAF4缺失導(dǎo)致SDH亞基的蛋白表達(dá)顯著下降，但復(fù)合物I、III、IV和V組分的豐度在這個(gè)年齡的突變心臟中沒有改變（Fig. 4b, c）。盡管Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟中SDH亞基的蛋白表達(dá)下降，但是它們的mRNA水平并未改變（Fig. 4d），所以作者推測(cè)，復(fù)合體II的異常很可能發(fā)生在翻譯后水平，主要是由于裝配缺陷。
接下來作者分析了SDHAF4缺失對(duì)復(fù)合物組裝的影響。使用心肌組織的免疫沉淀顯示Sdhaf4缺失減少了SDHA和SDHB之間的相互作用（Fig. 4e, f），這個(gè)可能導(dǎo)致SDH亞基降解，泛素化修飾水平增加證實(shí)了這一猜想（Fig. 4g）。此外，線粒體超復(fù)合物的形成被抑制，并在突變心臟中觀察到線粒體耗氧量的顯著下降（Fig. 4h–j）。有趣的是，出生3周后，相對(duì)ATP水平保持不變，但在8周齡的Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟中下降（Fig. 4k）。這些結(jié)果說明SDHAF4缺失阻斷復(fù)合體Ⅱ的組裝并導(dǎo)致線粒體呼吸異常。
圖4敲除SDHAF4后阻斷復(fù)合體Ⅱ的組裝并促進(jìn)線粒體功能異常
鑒于復(fù)合體II是耦合線粒體電子傳遞鏈和TCA循環(huán)的關(guān)鍵因素，所以作者接下來探究SDHAF4缺失是否會(huì)導(dǎo)致TCA循環(huán)相關(guān)關(guān)鍵酶和代謝物的豐度。突變體早期（出生后3周）心臟中TCA循環(huán)相關(guān)關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)水平與對(duì)照組沒有區(qū)別，而在8周后，心臟中這些酶的水平整體下降（Fig. 5a, b）。此外，TCA循環(huán)相關(guān)代謝物水平在突變體小鼠中顯著下降，包括丙酮酸，檸檬酸，異檸檬酸，蘋果酸，富馬酸，只有琥珀酸的豐度增加了（Fig. 5c）。這些變化是SDH活性喪失所導(dǎo)致的主要影響，而SDH活性是催化琥珀酸氧化為富馬酸鹽所必需的，這是TCA循環(huán)的關(guān)鍵步驟。進(jìn)一步的代謝組學(xué)分析顯示，SDHAF4缺失影響多個(gè)氨基酸代謝通路，其中精氨酸（Arg）生物合成通路改變最顯著（Fig. 5d, e）。TCA循環(huán)和精氨酸生物合成之間的關(guān)聯(lián)近來已有報(bào)道。精氨酸通過瓜氨酸-一氧化氮途徑再生，瓜氨酸和天門冬氨酸（Asp）通過精氨酸琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)轉(zhuǎn)化為精氨酸，富馬酸作為副產(chǎn)物，而富馬酸酶作用于富馬酸的產(chǎn)物蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸生成天門冬氨酸，加入精氨酸的生物合成循環(huán)（Fig. 5f）。因此，SDHAF4的缺失不僅主要改變了TCA循環(huán)相關(guān)代謝物的水平，還抑制了精氨酸的再生，進(jìn)一步加劇了代謝應(yīng)激。
圖5敲除SDHAF4后加速TCA循環(huán)相關(guān)代謝能力
5、阻斷復(fù)合體II的組裝改變心臟線粒體融合/裂變動(dòng)力學(xué)
盡管3周齡Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟的線粒體功能受損，但是細(xì)胞器的形態(tài)并未發(fā)生改變（Fig. 6a）。在TEM電鏡中，Sdhaf4 Ckmm小鼠和對(duì)照組線粒體數(shù)目及其亞細(xì)胞分布無差異（Fig. 6b–e）。然而，隨著病理性進(jìn)展加劇，8周齡Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟線粒體表現(xiàn)出明顯的形態(tài)異常，包括肌原纖維/肌節(jié)組織異常，線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)異常，如嵴畸形，電子密集的包裹體和低密度的隔室（Fig. 6f, g）；此外，線粒體總數(shù)顯著增加但線粒體大小顯著減?。‵ig. 6h–j）。
接下來探究Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟中線粒體數(shù)量增加但大小減小是否是由于線粒體生物發(fā)生和融合過程改變導(dǎo)致的。然而，qPCR分析顯示Sdhaf4 Ckmm小鼠心肌中mtDNA的相對(duì)豐度降低，而不是增加（Fig. 6k）。PGC-1α和其它線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)基因的表達(dá)在Sdhaf4 Ckmm小鼠中也都下調(diào)表達(dá)（Fig. 6l, m）。因此，這些細(xì)胞器數(shù)量的增加不太可能是由于線粒體生物發(fā)生的改變?cè)斐傻?。所以接下來作者測(cè)定了調(diào)節(jié)線粒體融合和裂變的多種因子的蛋白質(zhì)水平，但未檢測(cè)到對(duì)照組和突變心臟之間的顯著差異。但是，Drp1的轉(zhuǎn)錄后修飾在Sdhaf4 Ckmm小鼠中顯著改變，該基因是線粒體融合的關(guān)鍵基因。Drp1的激活高度依賴于兩個(gè)絲氨酸位點(diǎn)：絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化（p-Drp1 s616）增強(qiáng)線粒體融合，絲氨酸637位點(diǎn)磷酸化（p-Drp1 s637）抑制線粒體融合活性。作者發(fā)現(xiàn)在3周大的Sdhaf4 Ckmm小鼠中p-Drp1 s616增加而p-Drp1 s637下降（Fig. 6n）。Drp1的激活在8周大的Sdhaf4 Ckmm小鼠中也觀察到了（Fig. 6n, p），提示在SDHAF4缺失的情況下，Drp1在早期且持續(xù)激活。綜上所述，這些結(jié)果表明SDHAF4缺乏可能會(huì)增強(qiáng)線粒體裂變，導(dǎo)致細(xì)胞器碎裂，因而可能是線粒體數(shù)量增加的原因。
線粒體自噬通常與線粒體融合/裂變動(dòng)力學(xué)耦合，以使受損細(xì)胞器回收和清除。有趣的是，自噬激活的標(biāo)志LC3-II的水平在8周齡的Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟中顯著增加（Fig. 6o, p）。使用熒光報(bào)告基因(mt-Keima)方法評(píng)估H9C2大鼠心肌細(xì)胞線粒體自噬水平，證實(shí)了SDHAF4缺失導(dǎo)致線粒體自噬小體形成增加（Fig. 6q）。這些表明SDHAF4缺失導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的線粒體自噬。
圖6阻斷復(fù)合體Ⅱ的組裝促進(jìn)心臟線粒體自噬
6、線粒體靶向干預(yù)延長(zhǎng)DCM小鼠的壽命
基于前面的觀察，作者猜想代謝能力受損和線粒體自噬加速可能是DCM的Sdhaf4Ckmm小鼠中的兩個(gè)主要線粒體事件，因此，靶向代謝或藥物干預(yù)可能會(huì)有所療效。為驗(yàn)證該猜想，作者使用口服水富馬酸鈉或腹腔注射特異性Drp1抑制劑Mdivi-1處理小鼠。線粒體和肌纖維完整性通過補(bǔ)充富馬酸鹽或Mdivi-1得到改善（Fig. 7a）。線粒體數(shù)量和平均大小也基本恢復(fù)（Fig. 7b, c）。心臟肥厚和纖維相關(guān)基因，Anp的mRNA表達(dá)在兩個(gè)干預(yù)組中都顯著下降，Bnp和Myh7的上調(diào)也被Mdivi-1處理抑制（Fig. 7d）。心電圖顯示Mdivi-1處理顯著改善Sdhaf4Ckmm小鼠的心臟功能，表現(xiàn)為EF%和FS%上升（Fig. 7e–j）。重要的是，補(bǔ)充富馬酸鹽或Mdivi-1處理都顯著延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間（Fig. 7k）。表明以TCA代謝或線粒體動(dòng)力學(xué)為靶點(diǎn)的方法是治療心功能不全的有效方法。
圖7抑制Drp1或補(bǔ)充富馬酸可延長(zhǎng)擴(kuò)張型心肌病小鼠的壽命
由于富馬酸是SDH催化的直接產(chǎn)物，因此富馬酸丟失可能是Sdhaf4 Ckmm小鼠心臟的關(guān)鍵特征。值得注意的是富馬酸的下調(diào)和琥珀酸的上調(diào)都在MI小鼠中報(bào)道過，表明富馬酸鹽相關(guān)代謝異常可能是心臟發(fā)病的關(guān)鍵過程之一。為了驗(yàn)證該猜想，對(duì)MI小鼠術(shù)前術(shù)后補(bǔ)充富馬酸，結(jié)果顯示，與MI小鼠比較，富馬酸補(bǔ)充的MI小鼠的心臟重量/體重比顯著下降，EF%和FS%顯著增加，心臟肥厚和纖維相關(guān)基因也顯著回復(fù)（圖8）。這些結(jié)果說明直接補(bǔ)充富馬酸可改善MI小鼠的心臟功能。綜上所述，這些觀察結(jié)果提示MI患者SDHAF4相關(guān)富馬酸缺失在心功能障礙的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。
圖8 補(bǔ)充富馬酸可以改善MI小鼠的心功能
綜上所述，本文研究了SDHAF4在小鼠體內(nèi)的病理參與，以確定其在維持心功能中的重要作用。SDHAF4是新近發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜II組裝因子，其表達(dá)對(duì)應(yīng)激敏感。SDHAF4的缺失破壞了復(fù)合物II的組裝，促進(jìn)了SDH單位的降解，從而逐步導(dǎo)致代謝障礙和線粒體自噬過量，最終導(dǎo)致DCM和心力衰竭。此外，針對(duì)線粒體代謝和動(dòng)力學(xué)的干預(yù)是改善心臟功能的有效策略。小鼠SDHAF4蛋白的生理評(píng)價(jià)為復(fù)雜II缺陷相關(guān)DCM的發(fā)展和臨床實(shí)踐提供了更多的見解。
參考文獻(xiàn)：
Wang Xueqiang., Zhang Xing., Cao Ke., Zeng Mengqi., Fu Xuyang., Zheng Adi., Zhang Feng., Gao Feng., Zou Xuan., Li Hao., Li Min., Lv Weiqiang., Xu Jie., Long Jiangang., Zang Weijin., Chen Jinghai., Ding Jian., Liu Jiankang., Feng Zhihui.(2022). Cardiac disruption of SDHAF4-mediated mitochondrial complex II assembly promotes dilated cardiomyopathy. Nat Commun, 13(1), 3947. doi:10.1038/s41467-022-31548-1