范本文章之單細(xì)胞測(cè)序和功能實(shí)驗(yàn)的完美結(jié)合

骨髓細(xì)胞是肝硬化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，肝硬化是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。由于基質(zhì)細(xì)胞在體外可以調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞的功能，所以靶向基質(zhì)-髓系相互作用已成為一種有吸引力的潛在治療策略。本研究的目的是探討人肝基質(zhì)細(xì)胞如何影響骨髓細(xì)胞特性，并了解基質(zhì)-骨髓共培養(yǎng)系統(tǒng)這些相互作用在肝硬化背景下的效用。本研究最終揭示肝基質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)釋放IL-6調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的成熟和分化。本研究于20022年1月發(fā)表在《JOURNAL OF HEPATOLOGY》IF：30.083期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、肝硬化和非肝硬化細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜揭示差異細(xì)胞群

作者通過(guò)兩種方法研究了肝基質(zhì)細(xì)胞如何調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞表型，以及體外基質(zhì)-骨髓系統(tǒng)研究人類肝硬化的相關(guān)性。如圖1A，對(duì)肝基質(zhì)細(xì)胞和骨髓細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序；使用原代人基質(zhì)-髓系共培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)研究肝基質(zhì)細(xì)胞如何影響CD14 +細(xì)胞的成熟和分化。單細(xì)胞測(cè)序?qū)撬枳V系特征的集中分析顯示有5個(gè)主要的細(xì)胞群：血源性單核細(xì)胞（Mono1），CD16 +單核細(xì)胞（Mono2），KCs，SAM和髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞（mDC）（圖1B）。髓系細(xì)胞亞群的分類使用的是關(guān)鍵基因標(biāo)志物（圖1B-C），Mono1表達(dá)血源性單核基因CD14，LYZ，S100A9，S100A8；Mono2表達(dá)CD16陽(yáng)性單核基因FCGR3A，TIMP1，CD52；KC細(xì)胞表達(dá)C1QC，CD163，CTSB，F(xiàn)CGR3A；SAM細(xì)胞表達(dá)TREM2，CD9，F(xiàn)ABP5，SPP1，mDC細(xì)胞低表達(dá)CD14和上調(diào)的CD1C及CLEC10A?？傊?，肝硬化和非肝硬化細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜已經(jīng)具有明顯不同。

2、CD14⁺細(xì)胞HLA-DR上調(diào)提示巨噬細(xì)胞成熟

為單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的髓系細(xì)胞群生成基因特征，并使用DWLS方法估計(jì)了這些細(xì)胞群在培養(yǎng)的CD14+細(xì)胞中的相對(duì)豐度（圖1D）。如預(yù)期的，在共培養(yǎng)0h時(shí)，以Mono1亞群為主，然而，72h后，CD14+細(xì)胞向巨噬細(xì)胞亞群的表達(dá)譜轉(zhuǎn)變，如KCs和SAM。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果支持這一結(jié)論（圖1E）。這些結(jié)果表明共培養(yǎng)72小時(shí)后單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

由于巨噬細(xì)胞比單核細(xì)胞更適合呈遞抗原，所以作者檢測(cè)了HLA-DR的表達(dá)以區(qū)分人類巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。結(jié)果顯示和單核細(xì)胞亞群比較（Mono1和Mono1），HLA-DR的表達(dá)在巨噬細(xì)胞亞群（KCs和SAM）中上調(diào)（圖1F）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也證實(shí)CD14+細(xì)胞培養(yǎng)72h后HLA-DR的表達(dá)顯著上調(diào)（圖1G-H）。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72小時(shí)的細(xì)胞基因主要富集在Antigen processing and presentation via MHC class II的GO條目中。因此，這些結(jié)果表明HLA-DR的表達(dá)可鑒定巨噬細(xì)胞并且提示CD14+細(xì)胞向HLA-DR巨噬細(xì)胞成熟在培養(yǎng)72小時(shí)后。

圖1人CD14⁺細(xì)胞HLA-DR上調(diào)提示巨噬細(xì)胞成熟

3、基質(zhì)細(xì)胞限制人單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞成熟

為了研究基質(zhì)細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞成熟的影響，采用了人基質(zhì)-髓系共培養(yǎng)系統(tǒng)，將原代肝基質(zhì)細(xì)胞與新鮮分離的血液CD14+細(xì)胞共培養(yǎng)0-72小時(shí)（圖2A）?；|(zhì)細(xì)胞顯著降低了CD14+細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（圖2B）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果也支持這一結(jié)論（圖2C）。這些表明原代肝臟基質(zhì)細(xì)胞在體外限制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞成熟的轉(zhuǎn)變。

4、培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上類似于原纖維間充質(zhì)細(xì)胞亞群 Mes-2

為了區(qū)分哪個(gè)肝基質(zhì)細(xì)胞亞群在體外限制巨噬細(xì)胞成熟，作者比較了通過(guò) 單細(xì)胞測(cè)序的離體肝基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和通過(guò)批量 RNA-seq 的體外原代肝基質(zhì)細(xì)胞。亞聚類分析顯示了14種非造血細(xì)胞亞群，如圖2D-2F所示，每種類群根據(jù)區(qū)基因標(biāo)志物的特異性表達(dá)區(qū)分。使用 DWLS 分析將 scRNA-seq 亞群與體外基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄比對(duì)確定間充質(zhì)細(xì)胞亞群 Mes-2 為主要亞型，而 Mes-1、肝星狀細(xì)胞和各種內(nèi)皮細(xì)胞群的混合物為少數(shù)亞型（圖2G）。此外，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞限制巨噬細(xì)胞的成熟是依賴于細(xì)胞間之間接觸機(jī)制的（圖2H）。

圖2肝纖維化細(xì)胞限制巨噬細(xì)胞成熟

5、基質(zhì)細(xì)胞限制巨噬細(xì)胞向CD9⁺ SAMs的分化

由于CD9+ SAMs亞群在硬化肝臟中增加而CD163+ KC亞群減少，所以作者探究了是否基質(zhì)細(xì)胞改變了髓系細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞亞群的臨床相關(guān)性。RNA-seq分析顯示，CD14+細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)與SAMs相似，而CD14+細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)在轉(zhuǎn)錄上與KCs相似（圖3B）?；虮磉_(dá)分析證實(shí)了這種相關(guān)性，CD14+單獨(dú)培養(yǎng)CD9，F(xiàn)ABP5，TREM2的表達(dá)增加，類似SAMs亞群，但是和基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)則CD163，C1QA，CTSB的表達(dá)增加，類似KC亞群（圖3C）。因此，作者猜想CD9+和CD163+可能分別是SAMs亞群和KC亞群的標(biāo)記。為檢驗(yàn)該猜想，進(jìn)行了流式定量分析，CD14+細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)減少了CD9+的比率并增加了CD163+的比率（圖3D）。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了作者的猜想，即基質(zhì)細(xì)胞信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞分化可能通過(guò)限制SAM保護(hù)干燥免受纖維化。

圖3肝纖維化細(xì)胞減少CD9⁺ SAMs的分化

6、基質(zhì)可溶性因子足以限制SAM的分化且依賴于IL-6/IL-6R通路

鑒于基質(zhì)接觸是巨噬細(xì)胞成熟所必須的，作者評(píng)估了這種接觸是否也是巨噬細(xì)胞分化所必須的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清液轉(zhuǎn)移和共培養(yǎng)的方法都能誘導(dǎo)KC樣CD163+和限制SAM樣CD9+表達(dá)，提示基質(zhì)可溶性因子足以控制巨噬細(xì)胞分化（圖4A）。

隨后使用RNA-seq對(duì)體外基質(zhì)細(xì)胞和CD14 +細(xì)胞進(jìn)行了注釋的同源受體-配體對(duì)表達(dá)分析，以檢測(cè)控制巨噬細(xì)胞分化的潛在機(jī)制。識(shí)別到可溶性和依賴于接觸的注釋通路，但重點(diǎn)關(guān)注可溶性通路，因?yàn)樗鼈冏阋愿淖兎只▓D4B）。作者驗(yàn)證了一系列基質(zhì)-髓對(duì)，包括IL-6/IL-6R（圖4C）。與CD14+細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組比較，IL-6蛋白表達(dá)在共培養(yǎng)組顯著升高（圖4D），提示其可能參與兩者的相互作用。RNA-seq證實(shí)了IL-6在肝臟基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)和IL-6R在CD14+細(xì)胞的表達(dá)（圖4E）。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明基質(zhì)可溶性因子對(duì)SAM分化的限制依賴于IL-6/IL-6R通路。

圖4基質(zhì)可溶性因子足以限制SAM的分化和IL-6/IL-6R通路上調(diào)

7、基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的可溶性因子IL-6限制CD9⁺ SAMs的分化

為了進(jìn)一步探究是否是IL-6影響了巨噬細(xì)胞亞群分化，使用IL-6R抗體阻斷了IL-6信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6R抗體處理顯著降低了共培養(yǎng)體系和上清液體系中的CD163+ KC樣亞群，而增加了CD9+ SAM樣細(xì)胞亞群，表明CD+向CD163+分化受到限制（圖5A-B）。隨后作者探究通過(guò)IL-6/IL-6R復(fù)合物能否控制巨噬細(xì)胞分化。經(jīng)典的IL-6信號(hào)涉及IL-6與膜結(jié)合的IL-6R和gp130蛋白的相互作用，而反式IL-6信號(hào)允許IL-6與可溶性IL-6R復(fù)合體，并與細(xì)胞膜上的gp130蛋白相互作用。所以作者檢測(cè)了CD14+細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)72小時(shí)后，重組IL-6 （rIL-6）（經(jīng)典），或IL-6/IL-6R融合（FC-IL-6）（反式）蛋白CD9+和CD163+的表達(dá)，（圖5C）。這些結(jié)果表明經(jīng)典和反式IL-6都能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化。DWLSf分析證實(shí)rIL-6處理的CD14+細(xì)胞轉(zhuǎn)錄最大程度上接近于KC肝細(xì)胞亞群，類似于基質(zhì)共培養(yǎng)細(xì)胞（圖5D）。此外，圖5E-F的結(jié)果提示IL-6起源于肝臟基質(zhì)細(xì)胞亞群并分布于整個(gè)肝臟組織，并且基質(zhì)IL-6主要產(chǎn)生于Mes2細(xì)胞。臨床樣本證實(shí)，和健康對(duì)照的肝臟組織比較，IL-6的表達(dá)在NSAH和SS肝組織中顯著下降（圖5G）。這些結(jié)果表明基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的可溶性因子IL-6限制CD9+ SAMs的分化，并且認(rèn)為干預(yù)IL-6通路可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化。

圖5基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的可溶性因子IL-6限制CD9⁺ SAMs的分化

參考文獻(xiàn)：

Buonomo Erica L., Mei Shenglin., Guinn Samantha R., Leo Isabelle R., Peluso Michael J., Nolan Mei-An., Schildberg Frank A., Zhao Lei., Lian Christine., Xu Shuyun., Misdraji Joseph., Kharchenko Peter V., Sharpe Arlene H.(2022). Liver stromal cells restrict macrophage maturation and stromal IL-6 limits the differentiation of cirrhosis-linked macrophages. J Hepatol, 76(5), 1127-1137. doi:10.1016/j.jhep.2021.12.036