范本文章之單細胞測序和功能實驗的完美結(jié)合
骨髓細胞是肝硬化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，肝硬化是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。由于基質(zhì)細胞在體外可以調(diào)節(jié)髓系細胞的功能，所以靶向基質(zhì)-髓系相互作用已成為一種有吸引力的潛在治療策略。本研究的目的是探討人肝基質(zhì)細胞如何影響骨髓細胞特性，并了解基質(zhì)-骨髓共培養(yǎng)系統(tǒng)這些相互作用在肝硬化背景下的效用。本研究最終揭示肝基質(zhì)細胞可通過釋放IL-6調(diào)節(jié)巨噬細胞的成熟和分化。本研究于20022年1月發(fā)表在《JOURNAL OF HEPATOLOGY》IF：30.083期刊上。
技術(shù)路線
主要實驗結(jié)果
1、肝硬化和非肝硬化細胞的單細胞圖譜揭示差異細胞群
作者通過兩種方法研究了肝基質(zhì)細胞如何調(diào)節(jié)骨髓細胞表型，以及體外基質(zhì)-骨髓系統(tǒng)研究人類肝硬化的相關(guān)性。如圖1A，對肝基質(zhì)細胞和骨髓細胞進行單細胞測序；使用原代人基質(zhì)-髓系共培養(yǎng)系統(tǒng)來研究肝基質(zhì)細胞如何影響CD14 +細胞的成熟和分化。單細胞測序?qū)撬枳V系特征的集中分析顯示有5個主要的細胞群：血源性單核細胞（Mono1），CD16 +單核細胞（Mono2），KCs，SAM和髓源性樹突狀細胞（mDC）（圖1B）。髓系細胞亞群的分類使用的是關(guān)鍵基因標(biāo)志物（圖1B-C），Mono1表達血源性單核基因CD14，LYZ，S100A9，S100A8；Mono2表達CD16陽性單核基因FCGR3A，TIMP1，CD52；KC細胞表達C1QC，CD163，CTSB，F(xiàn)CGR3A；SAM細胞表達TREM2，CD9，F(xiàn)ABP5，SPP1，mDC細胞低表達CD14和上調(diào)的CD1C及CLEC10A?？傊?，肝硬化和非肝硬化細胞的單細胞圖譜已經(jīng)具有明顯不同。
2、CD14+細胞HLA-DR上調(diào)提示巨噬細胞成熟
為單細胞測序結(jié)果的髓系細胞群生成基因特征，并使用DWLS方法估計了這些細胞群在培養(yǎng)的CD14+細胞中的相對豐度（圖1D）。如預(yù)期的，在共培養(yǎng)0h時，以Mono1亞群為主，然而，72h后，CD14+細胞向巨噬細胞亞群的表達譜轉(zhuǎn)變，如KCs和SAM。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果支持這一結(jié)論（圖1E）。這些結(jié)果表明共培養(yǎng)72小時后單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)化。
由于巨噬細胞比單核細胞更適合呈遞抗原，所以作者檢測了HLA-DR的表達以區(qū)分人類巨噬細胞和單核細胞。結(jié)果顯示和單核細胞亞群比較（Mono1和Mono1），HLA-DR的表達在巨噬細胞亞群（KCs和SAM）中上調(diào)（圖1F）。轉(zhuǎn)錄組測序也證實CD14+細胞培養(yǎng)72h后HLA-DR的表達顯著上調(diào)（圖1G-H）。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72小時的細胞基因主要富集在Antigen processing and presentation via MHC class II的GO條目中。因此，這些結(jié)果表明HLA-DR的表達可鑒定巨噬細胞并且提示CD14+細胞向HLA-DR巨噬細胞成熟在培養(yǎng)72小時后。
圖1人CD14+細胞HLA-DR上調(diào)提示巨噬細胞成熟
3、基質(zhì)細胞限制人單核細胞向巨噬細胞成熟
為了研究基質(zhì)細胞對巨噬細胞成熟的影響，采用了人基質(zhì)-髓系共培養(yǎng)系統(tǒng)，將原代肝基質(zhì)細胞與新鮮分離的血液CD14+細胞共培養(yǎng)0-72小時（圖2A）。基質(zhì)細胞顯著降低了CD14+細胞向巨噬細胞的轉(zhuǎn)化（圖2B）。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果也支持這一結(jié)論（圖2C）。這些表明原代肝臟基質(zhì)細胞在體外限制單核細胞向巨噬細胞成熟的轉(zhuǎn)變。
4、培養(yǎng)的基質(zhì)細胞在轉(zhuǎn)錄上類似于原纖維間充質(zhì)細胞亞群 Mes-2
為了區(qū)分哪個肝基質(zhì)細胞亞群在體外限制巨噬細胞成熟，作者比較了通過 單細胞測序的離體肝基質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組和通過批量 RNA-seq 的體外原代肝基質(zhì)細胞。亞聚類分析顯示了14種非造血細胞亞群，如圖2D-2F所示，每種類群根據(jù)區(qū)基因標(biāo)志物的特異性表達區(qū)分。使用 DWLS 分析將 scRNA-seq 亞群與體外基質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄比對確定間充質(zhì)細胞亞群 Mes-2 為主要亞型，而 Mes-1、肝星狀細胞和各種內(nèi)皮細胞群的混合物為少數(shù)亞型（圖2G）。此外，進一步探究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞限制巨噬細胞的成熟是依賴于細胞間之間接觸機制的（圖2H）。
圖2肝纖維化細胞限制巨噬細胞成熟
5、基質(zhì)細胞限制巨噬細胞向CD9+ SAMs的分化
由于CD9+ SAMs亞群在硬化肝臟中增加而CD163+ KC亞群減少，所以作者探究了是否基質(zhì)細胞改變了髓系細胞分化為巨噬細胞亞群的臨床相關(guān)性。RNA-seq分析顯示，CD14+細胞單獨培養(yǎng)與SAMs相似，而CD14+細胞與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)在轉(zhuǎn)錄上與KCs相似（圖3B）?；虮磉_分析證實了這種相關(guān)性，CD14+單獨培養(yǎng)CD9，F(xiàn)ABP5，TREM2的表達增加，類似SAMs亞群，但是和基質(zhì)細胞共培養(yǎng)則CD163，C1QA，CTSB的表達增加，類似KC亞群（圖3C）。因此，作者猜想CD9+和CD163+可能分別是SAMs亞群和KC亞群的標(biāo)記。為檢驗該猜想，進行了流式定量分析，CD14+細胞與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)減少了CD9+的比率并增加了CD163+的比率（圖3D）。這些數(shù)據(jù)驗證了作者的猜想，即基質(zhì)細胞信號調(diào)控巨噬細胞分化可能通過限制SAM保護干燥免受纖維化。
6、基質(zhì)可溶性因子足以限制SAM的分化且依賴于IL-6/IL-6R通路
鑒于基質(zhì)接觸是巨噬細胞成熟所必須的，作者評估了這種接觸是否也是巨噬細胞分化所必須的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清液轉(zhuǎn)移和共培養(yǎng)的方法都能誘導(dǎo)KC樣CD163+和限制SAM樣CD9+表達，提示基質(zhì)可溶性因子足以控制巨噬細胞分化（圖4A）。
隨后使用RNA-seq對體外基質(zhì)細胞和CD14 +細胞進行了注釋的同源受體-配體對表達分析，以檢測控制巨噬細胞分化的潛在機制。識別到可溶性和依賴于接觸的注釋通路，但重點關(guān)注可溶性通路，因為它們足以改變分化（圖4B）。作者驗證了一系列基質(zhì)-髓對，包括IL-6/IL-6R（圖4C）。與CD14+細胞單獨培養(yǎng)組比較，IL-6蛋白表達在共培養(yǎng)組顯著升高（圖4D），提示其可能參與兩者的相互作用。RNA-seq證實了IL-6在肝臟基質(zhì)細胞中的表達和IL-6R在CD14+細胞的表達（圖4E）。這些數(shù)據(jù)說明基質(zhì)可溶性因子對SAM分化的限制依賴于IL-6/IL-6R通路。
圖4基質(zhì)可溶性因子足以限制SAM的分化和IL-6/IL-6R通路上調(diào)
7、基質(zhì)細胞來源的可溶性因子IL-6限制CD9+ SAMs的分化
為了進一步探究是否是IL-6影響了巨噬細胞亞群分化，使用IL-6R抗體阻斷了IL-6信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6R抗體處理顯著降低了共培養(yǎng)體系和上清液體系中的CD163+ KC樣亞群，而增加了CD9+ SAM樣細胞亞群，表明CD+向CD163+分化受到限制（圖5A-B）。隨后作者探究通過IL-6/IL-6R復(fù)合物能否控制巨噬細胞分化。經(jīng)典的IL-6信號涉及IL-6與膜結(jié)合的IL-6R和gp130蛋白的相互作用，而反式IL-6信號允許IL-6與可溶性IL-6R復(fù)合體，并與細胞膜上的gp130蛋白相互作用。所以作者檢測了CD14+細胞單獨培養(yǎng)72小時后，重組IL-6 （rIL-6）（經(jīng)典），或IL-6/IL-6R融合（FC-IL-6）（反式）蛋白CD9+和CD163+的表達，（圖5C）。這些結(jié)果表明經(jīng)典和反式IL-6都能調(diào)節(jié)巨噬細胞分化。DWLSf分析證實rIL-6處理的CD14+細胞轉(zhuǎn)錄最大程度上接近于KC肝細胞亞群，類似于基質(zhì)共培養(yǎng)細胞（圖5D）。此外，圖5E-F的結(jié)果提示IL-6起源于肝臟基質(zhì)細胞亞群并分布于整個肝臟組織，并且基質(zhì)IL-6主要產(chǎn)生于Mes2細胞。臨床樣本證實，和健康對照的肝臟組織比較，IL-6的表達在NSAH和SS肝組織中顯著下降（圖5G）。這些結(jié)果表明基質(zhì)細胞來源的可溶性因子IL-6限制CD9+ SAMs的分化，并且認為干預(yù)IL-6通路可調(diào)節(jié)巨噬細胞分化。
圖5基質(zhì)細胞來源的可溶性因子IL-6限制CD9+ SAMs的分化
參考文獻：
Buonomo Erica L., Mei Shenglin., Guinn Samantha R., Leo Isabelle R., Peluso Michael J., Nolan Mei-An., Schildberg Frank A., Zhao Lei., Lian Christine., Xu Shuyun., Misdraji Joseph., Kharchenko Peter V., Sharpe Arlene H.(2022). Liver stromal cells restrict macrophage maturation and stromal IL-6 limits the differentiation of cirrhosis-linked macrophages. J Hepatol, 76(5), 1127-1137. doi:10.1016/j.jhep.2021.12.036