作者通過(guò)分析環(huán)狀RNA在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)譜,鑒定了一個(gè)來(lái)自NEIL3的環(huán)狀RNA, hsa_circ_0001460,命名為circNEIL3,在體外和體內(nèi)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。隨后通過(guò)不同的通路,闡明circNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的分子機(jī)制。該文章發(fā)表在《Molecular Cancer》,IF: 41.44。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
1. CircNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)
作者首先分析了39個(gè)膠質(zhì)瘤組織(11個(gè)GBM和28個(gè)低級(jí)別膠質(zhì)瘤(LGG))和8個(gè)正常腦組織(NBTs)中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜?;鹕綀D顯示,在GBM和LGG之間,以及LGG和NBTs之間,circRNA表達(dá)有系統(tǒng)性差異(圖1A, B),在膠質(zhì)瘤組織中差異上調(diào)的環(huán)狀RNA (Log2FC≥4, P adj≤0.05),并鑒定出hsa_circ_0001460 (圖1C)。與NBTs相比,CircNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào),且隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加其表達(dá)增加(圖1D)。ROC曲線表示circNEIL3可預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后(圖1E)。通過(guò)UCSC基因組學(xué)研究所生物信息學(xué)網(wǎng)站,發(fā)現(xiàn)circNEIL3在NEIL3基因的第8外顯子和第9外顯子之間反接,長(zhǎng)度為596 nt(圖1)。使用發(fā)散引物擴(kuò)增circNEIL3的后剪接位點(diǎn),并通過(guò)Sanger測(cè)序確認(rèn)(圖1F)。凝膠電泳分析結(jié)果顯示,circNEIL3只能從cDNA中擴(kuò)增出來(lái),而從cDNA和gDNA中可以擴(kuò)增出線性形態(tài)(圖1G)。此外, RNase R和放線菌素D的處理證實(shí)了circNEIL3比NEIL3更穩(wěn)定(圖1H, I)。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)和FISH分析顯示,circNEIL3主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1J, K)。綜上所述,circNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào),且在GBM中表達(dá)最高,提示其參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展。
圖1 CircRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜和circNEIL3的特征
2. CircNEIL3在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生
功能實(shí)驗(yàn)表明:下調(diào)circNEIL3顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,過(guò)表達(dá)circNEIL3顯著促進(jìn)這些細(xì)胞行為(圖2A-D)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,circNEIL3下調(diào)可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲,延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間,而circNEIL3過(guò)表達(dá)則會(huì)產(chǎn)生相反的效果(圖2E、F)。此外,切除的腫瘤切片免疫組化顯示,circNEIL3敲低的腫瘤組織中Ki67和CD44的表達(dá)低于載體組,而circNEIL3過(guò)表達(dá)則相反(圖2G)。綜上所述,circNEIL3在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和膠質(zhì)瘤進(jìn)展方面具有重要的功能。
圖2 CircNEIL3在體外和體內(nèi)促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移
3. EWSR1促進(jìn)了circNEIL3在膠質(zhì)瘤中的生物發(fā)生
利用CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)和starBase 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)在circNEIL3的上下行區(qū)域預(yù)測(cè)了EWSR1的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn),分別稱為序列1、序列2和序列3(圖3A)。隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高,EWSR1表達(dá)水平升高,高表達(dá)的患者預(yù)后較差(圖3B)。此外,敲低EWSR1可以抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(圖3C、D)。在circRNA轉(zhuǎn)錄組中,發(fā)現(xiàn)circNEIL3與EWSR1呈正相關(guān)(圖3E),而在EWSR敲低的U251和A172細(xì)胞中,circNEIL3的表達(dá)明顯下降(圖3F)。將U251和A172細(xì)胞置于缺氧條件下0 h、6 h、12 h和24 h,隨著暴露時(shí)間的增加,EWSR1和circNEIL3的表達(dá)上調(diào)(圖3G,h)。通過(guò)RIP-qPCR檢測(cè)證實(shí),EWSR1能與NEIL3 pre-mRNA序列1和序列3結(jié)合,且在缺氧條件下結(jié)合能力顯著上調(diào)(圖3I)。最后設(shè)計(jì)拯救實(shí)驗(yàn), EWSR1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)U251和A172細(xì)胞增殖、遷移和侵襲增加,可通過(guò)下調(diào)circNEIL3來(lái)逆轉(zhuǎn)(圖3J-L)。
圖3 EWSR1促進(jìn)circNEIL3的生物發(fā)生
4. CircNEIL3在物理上與IGF2BP3相互作用,并抑制泛素/蛋白酶體介導(dǎo)的IGF2BP3降解
為了探索circNEIL3誘導(dǎo)GBM細(xì)胞進(jìn)展的分子機(jī)制,首先進(jìn)行了RNA下拉分析和質(zhì)譜分析,以探索與circNEIL3結(jié)合的潛在蛋白。共鑒定出50個(gè)與circNEIL3相互作用的蛋白,其中不包括AGO2,排除了circNEIL3作為ceRNA的可能性。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的RBP進(jìn)行交叉。發(fā)現(xiàn)circNEIL3與IGF2BP3蛋白結(jié)合(圖4A)。RNA pull-down和RIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)了circNEIL3與IGF2BP3的相互作用(圖4B, C)。RNA fish -免疫熒光分析,發(fā)現(xiàn)circNEIL3與IGF2BP3在細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖4D)。IGF2BP3由2個(gè)RNA識(shí)別基序(RMS)和4個(gè)KH結(jié)構(gòu)域組成。因此,建立了6個(gè)flag標(biāo)記的載體,并通過(guò)Western blot進(jìn)行了確認(rèn),以測(cè)試哪個(gè)區(qū)域與circNEIL3相互作用(圖4E, F)。RIP-qPCR檢測(cè)顯示,circNEIL3主要結(jié)合在KH3-4區(qū)域,表明這個(gè)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)招募circNEIL3(圖4G)。然后為了識(shí)別IGF2BP3結(jié)合的circNEIL3序列,設(shè)計(jì)了三個(gè)突變位點(diǎn),最終觀察到IGF2BP3與circNEIL3的第三個(gè)位點(diǎn)結(jié)合(圖4H)。這些結(jié)果表明circNEIL3在細(xì)胞質(zhì)中與IGF2BP3發(fā)生相互作用。
然而,circNEIL3并沒(méi)有顯著改變IGF2BP3的mRNA水平(圖4I),但顯著促進(jìn)IGF2BP3及其下游靶點(diǎn)CDK4/6、CD44和c-MYC的蛋白表達(dá)(圖4J),表明circNEIL3可能通過(guò)破壞IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定來(lái)調(diào)控膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。由于過(guò)表達(dá)circNEIL3可以提高IGF2BP3的蛋白表達(dá)水平,延長(zhǎng)IGF2BP3的半衰期(圖4K),表明circNEIL3通過(guò)蛋白酶體活性調(diào)控IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性。circNEIL3過(guò)表達(dá)降低了IGF2BP3的泛素化(圖4L)。然后,通過(guò)Ubibrowser數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出一個(gè)泛素化賴氨酸(K)殘基(K450),位于IGF2BP3的KH3結(jié)構(gòu)域(圖4N)。利用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了IGF2BP3的K450位點(diǎn)在6個(gè)物種中高度保守(圖4N),并將K450泛素化位點(diǎn)可視化(圖4O)。然后,作者將預(yù)測(cè)位點(diǎn)從賴氨酸(K)突變?yōu)榫彼?R),以確認(rèn)其作為泛素化靶點(diǎn)的作用。免疫沉淀(IP)結(jié)果顯示,與野生型IGF2BP3相比,K450突變顯著降低了IGF2BP3的泛素化水平,且在表達(dá)突變體的細(xì)胞中,cirNEIL3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的泛素化增強(qiáng)也被抑制(圖4M),突顯出K450是IGF2BP3的主要泛素化位點(diǎn)。這些結(jié)果表明,circNEIL3通過(guò)抑制泛素/蛋白酶體依賴的降解,增強(qiáng)IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性,從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。
圖4 CircNEIL3與IGF2BP3相互作用并抑制其泛素化
5. CircNEIL3通過(guò)抑制IGF2BP3蛋白HECTD4 -介導(dǎo)的泛素化
co-IP和質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)屬于E3泛素連接酶的HECD家族的蛋白HECTD4可以與IGF2BP3結(jié)合。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明HECTD4可以抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(圖5A, B)。免疫熒光實(shí)驗(yàn),證實(shí)IGF2BP3與細(xì)胞質(zhì)中的HECTD4共定位(圖5C)。此外,在HECTD4敲除GBM細(xì)胞中,IGF2BP3蛋白水平顯著升高(圖5D),而其泛素化水平明顯降低(圖5E),這表明在膠質(zhì)瘤中,HECTD4作為E3泛素連接酶通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解IGF2BP3。
過(guò)表達(dá)circNEIL3可以阻斷IGF2BP3與HECTD4的結(jié)合(圖5F),這解釋了circNEIL3是如何穩(wěn)定IGF2BP3的。Co-IP實(shí)驗(yàn)觀察到HECTD4結(jié)合在IGF2BP3的KH3-4結(jié)構(gòu)域,這是circNEIL3與IGF2BP3相互作用的同一位點(diǎn)(圖5G和圖4G)。這些數(shù)據(jù)表明circNEIL3通過(guò)阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化而穩(wěn)定IGF2BP3蛋白。
圖5 CircNEIL3阻斷IGF2BP3與HECTD4的結(jié)合
6. CircNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)
如圖6A所示,與circNEIL3低表達(dá)組相比,circNEIL3高表達(dá)組TME細(xì)胞浸潤(rùn)更多,免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分更高,腫瘤純度更低。與circNEIL3低表達(dá)的膠質(zhì)瘤相比,circNEIL3高表達(dá)的膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加。使用Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與NC組相比,過(guò)表達(dá)circNEIL3的GBM細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)顯著促進(jìn)THP1分化的巨噬細(xì)胞遷移(圖6B),而來(lái)自circNEIL3敲低的GBM細(xì)胞的CM則顯示相反的結(jié)果(圖6C)。總之,circNEIL3過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可以驅(qū)使巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到膠質(zhì)瘤微環(huán)境。
GSEA結(jié)果表明,與circNEIL3低樣本相比,circNEIL3高樣本中YAP1信號(hào)基因標(biāo)記高度富集(圖6D)。對(duì)TCGA膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行IGF2BP3的檢測(cè)也得到了同樣的結(jié)果(圖6E)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circNEIL3促進(jìn)CCL2和LOX表達(dá)的結(jié)果(圖6F),而這種由circNEIL3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的表達(dá)增強(qiáng)可以通過(guò)IGF2BP3敲低來(lái)拯救(圖6G)。最后,circNEIL3可以增加GBM細(xì)胞中YAP1和LOX的蛋白表達(dá)(圖6H)。過(guò)表達(dá)circNEIL3引起的表達(dá)增加也可以通過(guò)敲低IGF2BP3來(lái)消除(圖6I)??傊@些結(jié)果表明circneil3過(guò)表達(dá)的GBM細(xì)胞可能通過(guò)激活YAP1信號(hào)驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤相關(guān)的微環(huán)境。
圖6 CircNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)
7. CircNEIL3可通過(guò)hnRNPA2B1被包裝成外泌體
circNEIL3下拉實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)circNEIL3可以與hnRNPA2B1結(jié)合,hnRNPA2B1被報(bào)道可以運(yùn)輸各種RNA進(jìn)入外泌體。并且在GBM細(xì)胞中通過(guò)RIP和RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circNEIL3和hnRNPA2B1之間的相互作用(圖7A, B)。在hnRNPA2B1敲低的GBM細(xì)胞中,circNEIL3在細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),在外泌體中表達(dá)下調(diào)(圖7C)。綜上所述,這些結(jié)果表明,circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體。
8. 外泌體向TAMs傳遞circNEIL3,從而使TAMs通過(guò)穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,circNEIL3過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物CD163(圖7D)。隨著circNEIL3在外泌體中的表達(dá)增加,巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物、免疫抑制分子和SPP1(維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活并刺激血管生成)顯著上調(diào)(圖7E, F,圖S11J)??傊?,這些結(jié)果表明,外泌體可以將circNEIL3傳遞給TAMs,從而使它們獲得血管生成和免疫抑制特性。為了闡明circNEIL3介導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫抑制特性的機(jī)制,通過(guò)RNA下拉和RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在THP1分化的巨噬細(xì)胞中,circNEIL3與IGF2BP3結(jié)合的位點(diǎn)與腫瘤細(xì)胞相同(圖7G, H)。此外,在腫瘤細(xì)胞中觀察到,在THP1分化的巨噬細(xì)胞中,circNEIL3增加了IGF2BP3蛋白的表達(dá),抑制了IGF2BP3的泛素化(圖7I, J)。因此,與GBM細(xì)胞一樣,IGF2BP3可以作為circNEIL3在巨噬細(xì)胞中的下游效應(yīng)因子,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向免疫抑制表型極化。western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí),在THP1分化的巨噬細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)circNEIL3和IGF2BP3均能提高YAP1蛋白的表達(dá),而敲除它們的結(jié)果則相反(圖7K, L)。此外,敲除IGFB2P3可消除過(guò)表達(dá)circNEIL3對(duì)YAP1蛋白表達(dá)的增強(qiáng)(圖7M),表明circNEIL3通過(guò)穩(wěn)定IGF2BP3蛋白來(lái)增強(qiáng)YAP1的表達(dá),從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的免疫抑制表型極化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circNEIL3在體內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化的影響,將過(guò)表達(dá)cicrNEIL3的巨噬細(xì)胞或陰性對(duì)照載體與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共原位植入裸鼠大腦。與NC組相比,circNEIL3過(guò)表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)加快,荷瘤小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng)(圖7N-P)。為了進(jìn)一步證明circNEIL3通過(guò)IGF2BP3-YAP1軸發(fā)揮作用,在臨床膠質(zhì)瘤患者局部組織中進(jìn)行了免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果表明,IGF2BP3可以作為circNEIL3在巨噬細(xì)胞中的下游效應(yīng)因子,使巨噬細(xì)胞獲得免疫抑制特性,從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。
圖7外泌體可將circNEIL3傳遞給TAMs,從而使其獲得血管生成和免疫抑制特性
結(jié)論:
作者發(fā)現(xiàn)了一種在人腦膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)的新型環(huán)狀RNA circNEIL3。隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加,受EWSR1調(diào)控的circNEIL3表達(dá)增加。在功能上, circNEIL3在體外和體內(nèi)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。從機(jī)制上講,circNEIL3通過(guò)阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化來(lái)穩(wěn)定IGF2BP3,這是一種已知的致癌蛋白。此外,circNEIL3過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞可驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至TME。最后,circNEIL3可通過(guò)hnRNPA2B1打包成外泌體,傳遞給浸潤(rùn)的TAMs,從而使其通過(guò)穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性,進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展(圖7Q)。這些研究結(jié)果表明,circNEIL3可能是一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和有希望的膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)。