44分——ceRNA機(jī)制的正反饋環(huán)
大量研究表明circRNA和m6A甲基化修飾參與了包括肝細(xì)胞癌（HCC）在內(nèi)的多種惡性腫瘤的病理進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但是circRNA如何和m6A甲基化修飾形成發(fā)聵環(huán)作用于HCC進(jìn)展尚不清楚。本研究證實circGPR137B通過circGPR137B/miR-4739/FTO反饋環(huán)促進(jìn)HCC的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。這種通過circRNA和m6a修飾事件之間的功能耦合執(zhí)行的正反饋機(jī)制為表觀遺傳學(xué)提供了一種新的模型機(jī)制。本研究于2022年6月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。
技術(shù)路線
主要實驗結(jié)果：
1、circGPR137B下調(diào)和HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
對3對HCC腫瘤組織和配對癌旁組織進(jìn)行測序，其差異表達(dá)circRNA熱圖如圖1A所示，在P < 0.05和FC > 1.5的標(biāo)準(zhǔn)篩選后，在HCC中得到96個上調(diào)和51個下調(diào)的circRNA（圖1B）?；鹕綀D顯示hsa_circ_0017114，一個來源于線性RNA GPR137B的circRNA，在HCC中顯著下調(diào)表達(dá)，將其命名為circGPR137B（圖1C）。circRNA表達(dá)譜和RT-qPCR均表明相比于癌旁組織circGPR137B在HCC中下調(diào)（圖1D-1E）。隨后在87對HCC和癌旁組織中進(jìn)一步證實了這個結(jié)果（圖1F-1G）。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)和circGPR137B高表達(dá)組比較，circGPR137B低表達(dá)組具有較差的生存預(yù)后（圖1H-1I）。以上結(jié)果表明circGPR137B下調(diào)和HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。
圖1 circGPR137B下調(diào)和HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
hsa_circ_0017114來源于14q1(q42.3)染色體上GPR137B的外顯子1，7區(qū)域，命名為circGPR137B，其基因組序列是40204nt，剪切長度是1537nt（圖2A）。HepG2和Hep3B細(xì)胞在RNase R中暴露2小時，發(fā)現(xiàn)GPR137B的表達(dá)顯著下降而circGPR137B的表達(dá)因其抗性而無明顯改變（圖2B）。隨后探究了circGPR137B在actinomycin D暴露中的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示circGPR137B的半衰期顯著長于GPR137B（圖2C）。RT-qPCR和FISH實驗表明HCC組織中circGPR137B主要定位于染色質(zhì)（圖2D-2E）。
圖2 HCC細(xì)胞中circGPR137B的特征
3、在體外circGPR137B抑制HCC細(xì)胞的生長和侵襲
作者檢測了6株HCC細(xì)胞系中circGPR137B的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常肝細(xì)胞系比較，其在SK-hep-1細(xì)胞系中表達(dá)最高，在Hep3B中的表達(dá)最低（圖3A）。所以后續(xù)在SK-hep-1細(xì)胞系中進(jìn)行circGPR137B的敲低實驗，在Hep3B中進(jìn)行circGPR137B過表達(dá)實驗（圖3B）。MTT，集落形成和Transwell實驗顯示circGPR137B過表達(dá)HCC細(xì)胞的生長和侵襲，circGPR137B敲低則效果相反（圖3C-3E）。以上表明circGPR137B在HCC中發(fā)揮抑癌作用。
圖3在體外CircGPR137B抑制細(xì)胞生長
4、在HCC中miR-4739的表達(dá)和circGPR137B負(fù)相關(guān)和HCC不良預(yù)后相關(guān)
基于circRNA表達(dá)譜和miRbase在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)circGPR137B擁有5個潛在結(jié)合的miRNA（圖4A），它們的結(jié)合位點如圖4B所示。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示circGPR137B的熒光素酶活性只在miR-4739 mimics處理時顯著降低而非另外4個miRNA（圖4C）。FISH結(jié)果顯示相比于癌旁組織miR-4739的表達(dá)在HCC中顯著上調(diào)（圖4D-4E），并且miR-4739表達(dá)和circGPR137B顯著負(fù)相關(guān)（圖4F）。TCGA數(shù)據(jù)也證實miR-4739表達(dá)在HCC中顯著上調(diào)，且和不良預(yù)后相關(guān)（圖4G-4H）。以上說明HCC中miR-4739高表達(dá)且預(yù)示不良預(yù)后。
圖4 在HCC中CircGPR137B與miR-4739呈負(fù)相關(guān)
5、在HCC中circGPR137B是miR-4739的海綿
基于上述結(jié)果作者選擇miR-4739用于進(jìn)一步實驗。過表達(dá)circGPR137B顯著降低miR-4739的表達(dá)（圖5B）。此外，野生型circGPR137B和miR-4739的結(jié)合位點如圖5A所示，同時構(gòu)建了結(jié)合位點突變的circGPR137B熒光素酶報告基因載體。結(jié)果顯示在野生型中，circGPR137B的熒光素酶活性在miR-4739過表達(dá)組顯著降低，但是miR-4739突變后不改變，此外，在circGPR137B突變體中，miR-4739過表達(dá)不影響circGPR137B的熒光素酶活性（圖5C）。AGO2-RIP顯示和對照組比較內(nèi)源性circGPR137B和miR-4739的富集可被Ago2抗體拉下（圖5D）。FISH分析發(fā)現(xiàn)circGPR137B和miR-4739具有明顯的細(xì)胞質(zhì)共定位（圖5E）。此外，細(xì)胞功能實驗表明miR-4739過表達(dá)可顯著抵消circGPR137B過表達(dá)對HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖和侵襲的抑制效果（圖5F-5G）。這些結(jié)果表明在HCC中circGPR137B可靶向調(diào)控miR-4739。
圖5 在HCC中circGPR137B是miR-4739的海綿
6、在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調(diào)FTO
根據(jù)TargetScan7.1的結(jié)果，F(xiàn)TO可能是miR-4739的靶基因（圖6A）。熒光素酶實驗證實FTO和miR-4739可相互結(jié)合（圖5B），并且miR-4739過表達(dá)可顯著降低FTO，p21，p27，caspase-3/9和E-cadherin的表達(dá)，升高N-cadherin和vimentin的表達(dá)（圖6C-6D）。此外，miR-4739過表達(dá)也可逆轉(zhuǎn)circGPR137B對上述基因表達(dá)的影響。共轉(zhuǎn)染FTO質(zhì)粒和miR-4739 mimics后可觀察到FTO過表達(dá)顯著阻止了miR-4739過表達(dá)帶來的促腫瘤作用（圖6E-6G）。這些結(jié)果提示在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調(diào)FTO。
圖6 在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調(diào)FTO
隨后作者分析了FTO在HCC中的表達(dá)模式和預(yù)后價值，結(jié)果和預(yù)期一致，F(xiàn)TO表達(dá)在HCC組織中顯著下降，且FTO下調(diào)與HCC預(yù)后不良有關(guān)（圖7）。
圖7 FTO下調(diào)提示HCC預(yù)后不良
7、FTO介導(dǎo)circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環(huán)路
此前有研究表明腫瘤中circRNA會發(fā)生m6A修飾，而FTO是去甲基化酶，所以作者猜想FTO是通過介導(dǎo)circGPR137B的m6A修飾參與HCC進(jìn)展。在HepG2和Hep3B細(xì)胞中，過表達(dá)FTO均可顯著降低總體的m6A水平（圖8A-8B）以及circGPR137B的m6A水平（圖8C），但顯著增加了circGPR137B的表達(dá)水平（圖8D）。敲低FTO則降低circGPR137B的表達(dá)（圖8E）。此外，敲低circGPR137B的表達(dá)也可顯著增加miR-4739的表達(dá)增加FTO的表達(dá)（圖8F），而miR-4739抑制劑處理則增加FTO的表達(dá)（圖8G）。RIP實驗揭示FTO可以結(jié)合circGPR137B（圖8H）。重要的是，敲低circGPR137B可顯著逆轉(zhuǎn)FTO過表達(dá)引起的抗腫瘤效果（圖8I-8J）。以上說明，F(xiàn)TO介導(dǎo)circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環(huán)路調(diào)控HCC進(jìn)展。
圖8 FTO介導(dǎo)circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環(huán)路
8、在體內(nèi)circGPR137B抑制HCC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移
如圖9和圖10所示，過表達(dá)circGPR137B顯著增加HCC腫瘤的體積和重量，促進(jìn)病理性改變，增加腫瘤增殖和FTO表達(dá)，同時也顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成，而敲低circGPR137B表達(dá)則效果完全相反。表明在體內(nèi)circGPR137B抑制HCC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。
圖9 CircGPR137B抑制體內(nèi)HCC腫瘤發(fā)生
圖10 CircGPR137B抑制體內(nèi)HCC的肺轉(zhuǎn)移
綜上所述，本研究證實circGPR137B通過正反饋回路抑制肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移。CircGPR137B 通過海綿吸附 miR-4739 誘導(dǎo) FTO表達(dá)。FTO蛋白進(jìn)入細(xì)胞核介導(dǎo)circGPR137B的m6A去甲基化并促進(jìn)其表達(dá)，因此，對circGPR137B 產(chǎn)生形成正反饋，從而強(qiáng)烈抑制肝癌細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和肺遷移。
圖11本研究的機(jī)制模擬圖
參考文獻(xiàn)：
Liu Lianyong., Gu Mingjun., Ma Junhua., Wang Ying., Li Miao., Wang Hui., Yin Xin., Li Xiangqi.(2022). CircGPR137B/miR-4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer, 21(1), 149. doi:10.1186/s12943-022-01619-4