小CDD|外泌體：【細(xì)胞交互】+【分子交互】，一文get研究思路

在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展中，作者發(fā)現(xiàn)外泌體來(lái)源的circWDR62誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺（TMZ）產(chǎn)生抗性并促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲潛能。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，circWDR62通過(guò)調(diào)節(jié)miR-370-3p/MGMT軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性表型。本文于2022年7月發(fā)表在《Cell Death Disease》雜志上，IF=9.685。

技術(shù)路線圖

主要結(jié)果

1）在對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circWDR62表達(dá)水平上調(diào)。

首先，為探索對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體中circRNA的表達(dá)，作者通過(guò)梯度誘導(dǎo)的方法成功地建立了穩(wěn)定對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（附圖1A-F）并分離膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體。透射電鏡表明由U343-R和U343細(xì)胞分泌的外泌體是圓形的（圖 1A）。外泌體濃度粒徑分析表明U343-R細(xì)胞分泌的外泌體（U343-R-exos）和U343細(xì)胞分泌的外泌體（U343-exos）的濃度分別為12.0×107/mL和8.6×107/mL；此外，大多數(shù)顆粒的直徑在50-250 nm；U343-R-exos和U343-exos直徑的中位值分別是142.4 nm和129.6 nm（圖 1B）。Western blot結(jié)果表明外泌體特異性標(biāo)記CD63和TSG101在U343-R和U343細(xì)胞的外泌體表達(dá)（圖 1C）。這些結(jié)果證實(shí)成功提取到標(biāo)準(zhǔn)外泌體。為篩選對(duì)TMZ敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和耐TMZ的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體之間的差異表達(dá)的circRNA，作者對(duì)U343-R-exos和U343-exos進(jìn)行了微陣列分析?；鹕綀D結(jié)果提示與U343-exos相比，U343-R-exos中差異表達(dá)數(shù)千個(gè)circRNA（圖 1D）。Hsa_circ_0050688是其中表達(dá)水平最高的circRNA之一（圖 1E）。通過(guò)UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，作者將circ_0050688的結(jié)構(gòu)和定位進(jìn)行可視化分析并發(fā)現(xiàn)其來(lái)源于宿主基因WDR62（圖1F）。此外，circPrimer軟件表明circ_0050688由WDR62基因的第8-15外顯子經(jīng)反向剪接而形成。該circRNA成熟轉(zhuǎn)錄本的序列長(zhǎng)度為1076 nt，作者稱(chēng)為“hsa_circ_0050688”或“ circWDR62”（圖 1G）。此外，circWDR62能夠抵抗RNase R的消化；然而，經(jīng)過(guò)RNase R處理后，WDR62 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（圖1H）。qRT-PCR顯示，與原發(fā)腫瘤患者相比，來(lái)自復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤患者血清樣本的外泌體中circWDR62的表達(dá)顯著升高；膠質(zhì)瘤患者中circWDR62的表達(dá)高于正常對(duì)照組(圖 1I)。如圖1J所示，復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者組織中circWDR62的表達(dá)高于原發(fā)性腫瘤患者。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示，circWDR62低表達(dá)組復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的生存率高于高表達(dá)組（圖1K）。這些結(jié)果提示，外泌體circWDR62的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。

附圖1 構(gòu)建對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞

圖1在對(duì)TMZ抵抗的的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中circWDR62的表達(dá)上調(diào)。

2）敲低circWDR62抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的抗性和惡性進(jìn)展。

進(jìn)一步，為探索circWDR62的生物學(xué)功能，作者評(píng)估了circWDR62在U343-R和U251-R細(xì)胞以及對(duì)TMZ敏感的細(xì)胞中的表達(dá)水平。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，與與對(duì)TMZ敏感的細(xì)胞及其分泌的外泌體相比，兩種耐TMZ的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及外泌體中circWDR62的表達(dá)水平顯著增加（附圖2A&B）。由于circWDR62在TMZ耐藥細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，因此構(gòu)建circWDR62敲低模型用于評(píng)估其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型中的作用（附圖2C）。敲低circWDR62降低了U343-R和U251-R細(xì)胞中TMZ的IC50、增殖活性、遷移和侵襲（附圖2D-G）。

附圖2敲低circWDR62抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的抗性和惡性進(jìn)展。

3）circWDR62通過(guò)充當(dāng)miR-370-3p的海綿來(lái)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的抗性和惡性表型

為了進(jìn)一步闡明circWDR62的作用機(jī)理，作者通過(guò)circBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選篩選到circWDR62潛在的miRNA。作者專(zhuān)注于9種與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展和TMZ耐藥性密切相關(guān)的miRNA，并具有強(qiáng)的結(jié)合潛能的miRNA作為后續(xù)篩查的關(guān)鍵研究對(duì)象。在這些miRNA中，miR-370-3p和circWDR62結(jié)合。Fish實(shí)驗(yàn)表明，miR-370-3p和circWDR62共同定位于在U343-R和U251-R細(xì)胞胞質(zhì)中（圖2A），這表明circWDR62可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的miRNA海綿。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了miR-370-3p和circWDR62之間潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖2B）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，miR-370-3p mimics顯著抑制野生型circWDR62的熒光素酶的活性；但是對(duì)于突變型circWDR62的熒光素酶的活性沒(méi)有顯著的影響（圖2C）。這些數(shù)據(jù)表明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中circWDR62可吸附miR-370-3p。

圖2 circWDR62通過(guò)充當(dāng)miR-370-3p的海綿來(lái)促進(jìn)TMZ耐藥和細(xì)胞增殖。

為探索circWDR62的海綿機(jī)制，作者設(shè)計(jì)了circWDR62 shRNA和miR-370-3p抑制劑。轉(zhuǎn)染sh-circWDR62后，顯著下調(diào)了U343-R和U251-R細(xì)胞中circWDR62的表達(dá)（圖1L）。然而，sh-circWDR62沒(méi)有顯著改變WDR62 mRNA表達(dá)（圖1M）。qRT-PCR分析表明，將miR-370-3p抑制劑轉(zhuǎn)染U343-R和U251-R細(xì)胞后miR-370-3p的表達(dá)中被下調(diào)（圖2D）。與陰性對(duì)照組相比，敲低circWDR62后顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的IC50，而miR-370-3p的抑制劑顯著增加了U343-R和U251-R細(xì)胞的IC50。然而，在U343-R和U251-R細(xì)胞中敲低circWDR62引起的調(diào)控作用可被共轉(zhuǎn)染miR-370-3p抑制劑削弱（圖2E）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，miR-370-3p抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了因敲低circWDR62對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型的抑制作用，包括細(xì)胞增殖（圖2F）、遷移（圖3A）、侵襲（圖3B）、靶基因PCNA、增殖相關(guān)標(biāo)記PCNA、EMT相關(guān)蛋白（圖3C-G）。

圖3 circWDR62通過(guò)充當(dāng)miR-370-3p的海綿來(lái)促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移。

4）MGMT是膠質(zhì)瘤中circWDR62/miR-370-3p軸的直接靶基因。

采用三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（miRDB, miRTarBase, and TargetScan）預(yù)測(cè)miRNA的潛在靶標(biāo)mRNA。維恩圖顯示23個(gè)mRNA是miR-370-3p的最可能靶基因（圖4A）。進(jìn)一步，敲低circWDR62后作者檢測(cè)了潛在靶基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明FOXO1表達(dá)沒(méi)有顯著變化（圖4B）和MGMT表達(dá)降低（圖4C）。如圖4D所示，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-370-3p和MGMT之間潛在的結(jié)合位點(diǎn)。與TMZ敏感的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，在TMZ耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)（圖4E）。此外，GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)表明MGMT高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的總生存率較低有關(guān)（圖4F）。此外，F(xiàn)ish結(jié)果表明，在U343-R和U251-R細(xì)胞中，miR-370-3p和MGMT共定位在細(xì)胞質(zhì)（圖4G）。

圖4 MGMT是膠質(zhì)瘤中circWDR62/miR-370-3p軸的直接靶基因。

進(jìn)一步，挽救性實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)MGMT顯著逆轉(zhuǎn)了敲低circWDR62引起的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ抗性的抑制作用（圖5A）。此外，MGMT過(guò)表達(dá)削弱了敲低circWDR62引起對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型的抑制作用，包括增殖、遷移和侵襲（圖5B-D）。

圖 5 MGMT過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circWDR62敲低誘導(dǎo)的TMZ耐藥性和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

5）circWDR62增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤TMZ耐藥性和體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)

為了在體內(nèi)研究膠質(zhì)瘤中circWDR62和TMZ抗性之間的關(guān)系，作者構(gòu)建動(dòng)物模型。每3天將TMZ注射到裸鼠體內(nèi)。轉(zhuǎn)染shRNA-circWDR62組的腫瘤顯著小于對(duì)照組（圖6A）。兩組小鼠的體重沒(méi)有顯著性的差異（圖6B）。然而，無(wú)論TMA處理如何，敲低circWDRE62顯著抑制腫瘤體積和重量（圖6C&D）。另外，與shRNA-NC組相比，在shRNA- circWDR62組中，腫瘤組織中circWDR62的表達(dá)被下調(diào)（圖6E）。此外，WB分析證實(shí)，shRNA- circWDR62組中MGMT蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組（圖6F）。

圖6 CircWDR62增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ耐藥性和體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。

6）在體外和體內(nèi)外泌體介導(dǎo)的cirwDR62的傳遞誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤的TMZ耐藥性和惡性進(jìn)展

隨后，將PKH67標(biāo)記的TMZ抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體與TMZ敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)（圖7A）。可以觀察到對(duì)TMA敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取了對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體（圖7B）。qRT-PCR分析結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞衍生的外泌體處理后，對(duì)TMZ敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞后中cirwDR62的表達(dá)水平顯著升高，并且隨著外泌體的濃度增加，在TMZ敏感的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高（圖 7C）。但是，在添加GW4869（外泌體分泌阻滯劑）后，在Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中cirwDR62的表達(dá)顯著降低（圖7D）。這些結(jié)果表明，來(lái)自于抗TMZ的膠質(zhì)瘤的circWDR62可經(jīng)由外泌體傳遞到對(duì)TMZ敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。進(jìn)一步，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過(guò)來(lái)源于對(duì)TMZ抵抗的膠質(zhì)瘤細(xì)胞所分泌的外泌體處理后，U343和U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲潛能顯著增強(qiáng)（圖7E-G）。

圖7外泌體介導(dǎo)的cirWDR62遞送可在體外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的TMZ耐藥性和惡性進(jìn)展。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)U343-R來(lái)源的外泌體處理后，U343組的腫瘤大小、體重和體積顯著高于對(duì)照組；但是兩組中小鼠的體重沒(méi)有顯著差異（圖8A-D）。此外，與U343組相比，U343+U343-R-exo組中circWDR62的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖8E）。因此，circWDR62可以通過(guò)外泌體在TMZ抗性和TMZ敏感的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間運(yùn)輸。來(lái)自TMZ耐藥的細(xì)胞的外泌體circWDR62在受體敏感細(xì)胞中賦予了TMZ耐藥性，同時(shí)還增強(qiáng)了受體敏感細(xì)胞的細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。總而言之，這些結(jié)果表明外泌體來(lái)源于circWDR62通過(guò)吸附miR-370-3p來(lái)調(diào)節(jié)MGMT表達(dá)，從而導(dǎo)致質(zhì)瘤的TMZ耐藥性和惡性進(jìn)展（圖8F）。

圖8外泌體介導(dǎo)的cirWDR62傳輸可誘導(dǎo)體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的TMZ耐藥性和惡性進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)

Xiuchao Geng, Yuhao Zhang, Xiaomeng Lin, Zhaomu Zeng, Jun Hu, Liangchao Hao, Jianglong Xu,  Xinjuan Wang, Hong Wang, Qiang Li. Exosomal circWDR62 promotes temozolomide resistance and malignant progression through regulation of the miR-370-3p/MGMT axis in glioma. Cell Death Dis. 2022 Jul 11;13(7):596. doi: 10.1038/s41419-022-05056-5.