食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)-circBCAR3

circRNAs已被證明有助于食管癌的進(jìn)展。生物信息學(xué)分析預(yù)測circBCAR3在食管癌中存在差異表達(dá)。我們研究了circBCAR3在食管癌發(fā)生中的致癌作用和生物發(fā)生。circBCAR3在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，體外缺氧使其表達(dá)增加。沉默circBCAR3可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。缺氧誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞遷移和鐵死亡的促進(jìn)作用通過下調(diào)circBCAR3得以恢復(fù)。在機(jī)制上，剪接因子QKI促進(jìn)circBCAR3的生物發(fā)生，通過與miR-27a-3p結(jié)合上調(diào)TNPO1，加速食管癌的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)提示circBCAR3可能是食管癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。本文于2022年7月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=41.444）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）CircBCAR3在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

為了了解circBCAR3在食管癌中的表達(dá)情況，我們首先從GEO數(shù)據(jù)庫中分析了circRNAs在食管癌中的表達(dá)情況?；贕SE150476和GSE112496數(shù)據(jù)集，有5個(gè)circRNAs在食管癌中存在差異表達(dá)(圖1A)。為了探索缺氧條件下食管癌中這些異常circRNAs的表達(dá)是否會發(fā)生改變，我們檢測了缺氧處理后EC109細(xì)胞中它們的表達(dá)水平。Hsa_circ_0007624在缺氧處理后被發(fā)現(xiàn)上調(diào)(圖1B)。通過PCR證實(shí)hsa_circ_0007624 (circBCAR3)表達(dá)上調(diào)，結(jié)果顯示circBCAR3在食管癌腫瘤樣本和細(xì)胞系中表達(dá)明顯升高(圖1C, D)，BCAR3 pe-mRNA的2,3,4,5外顯子反向拼接形成circBCAR3的閉環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1E)。環(huán)狀(circBCAR3)對RNase R的抗性更強(qiáng)，而線性形式(BCAR3 mRNA)顯著衰減(圖1F)。此外，經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理后，circBCAR3的轉(zhuǎn)錄半衰期長于BCAR3 mRNA，這表明circBCAR3的穩(wěn)定性高于BCAR3 mRNA(圖1G)。circBCAR3由cDNA中的發(fā)散引物擴(kuò)增，證實(shí)了環(huán)狀BCAR3外顯子的存在，并排除了反式剪接產(chǎn)物(圖1H)。隨后對EC109和KYSE150細(xì)胞進(jìn)行了RNA-FISH檢測，結(jié)果顯示circBCAR3主要存在于食管癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1I)。

2）CircBCAR3敲低可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為了研究circBCAR3在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)shRNAs，在EC109和KYSE150細(xì)胞中有效地沉默circBCAR3(圖2A)。CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)顯示沉默的circBCAR3抑制了EC109和KYSE150細(xì)胞的活力和增殖(圖2B-D)。創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)(包括遷移和侵襲)表明，下調(diào)circBCAR3抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2E, F)。

3）CircBCAR3敲低可以抑制食管癌細(xì)胞鐵死亡

進(jìn)一步探討了circBCAR3敲除對鐵死亡的影響。如圖3A-D所示，sh-circBCAR3降低了細(xì)胞內(nèi)Fe2+、MDA、脂質(zhì)ROS，并增加了GSH水平。透射電鏡觀察到sh-circBCAR3在食管癌細(xì)胞中減少鐵死亡的典型形態(tài)變化(圖3E)。如圖3F所示，沉默circBCAR3后，GPX4蛋白水平升高。

4）CircBCAR3敲低逆轉(zhuǎn)了缺氧對食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的影響

我們進(jìn)行功能研究以評估circBCAR3是否介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞惡性行為的改變。結(jié)果表明，缺氧處理可顯著促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡。CircBCAR3敲除顯著逆轉(zhuǎn)了缺氧的這些效應(yīng)(圖4)。

5）沉默的circBCAR3在體內(nèi)抑制食管癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

為了研究circBCAR3在體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過注射穩(wěn)定表達(dá)sh-nc和sh-circBCAR3的細(xì)胞建立小鼠食管異種移植瘤。結(jié)果表明，circBCAR3缺乏降低了小鼠食管腫瘤的體積和重量(圖5A-C)。免疫組化染色結(jié)果表明，沉默的circBCAR3可降低增殖標(biāo)志物ki67的表達(dá)。H&E染色結(jié)果顯示，sh-nc組腫瘤細(xì)胞分布密集，細(xì)胞形態(tài)正常，而sh-circBCAR3組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核縮小較多(圖5D)。隨后，我們建立了腫瘤轉(zhuǎn)移模型，通過尾靜脈注射食管癌細(xì)胞來監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移。生物發(fā)光圖像顯示沉默的circBCAR3誘導(dǎo)小鼠的腫瘤抑制，這可以從生物發(fā)光強(qiáng)度的下降中得到證明(圖5E)。與對照組相比，沉默circBCAR3抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移(圖5F)。H&E染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一趨勢(圖5G)。免疫組化染色顯示，敲除circBCAR3可以抑制肺組織中波形蛋白、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)(圖5H)。這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)，circBCAR3的下調(diào)可以減弱食管癌的生長和轉(zhuǎn)移。

6）在食管癌細(xì)胞中circBCAR3負(fù)向調(diào)控miR-27a-3p

從ENCORI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測與circBCAR3結(jié)合的潛在miRNAs。我們關(guān)注miR-27a-3p是因?yàn)樗母吲琶?。miR-27a-3p與circBCAR3的結(jié)合位點(diǎn)如圖6A所示。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circBCAR3負(fù)調(diào)控野生型miR-27a-3p(圖6B)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，Ago2是miRNA機(jī)制的效應(yīng)物，可以與miR-27a-3p和circBCAR3結(jié)合(圖6C, D)。與對照組相比，在EC109和KYSE150細(xì)胞中轉(zhuǎn)染circBCAR3 shRNAs可提高miR-27a-3p的表達(dá)水平，過表達(dá)circBCAR3可降低miR-27a-3p的表達(dá)水平(圖6E)。此外，為了確定circBCAR3和miR-27a-3p在食管癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布，我們進(jìn)行了RNA-FISH實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明circBCAR3和miR-27a-3p均位于細(xì)胞質(zhì)中(圖6F)。

7）TNPO1在食管癌細(xì)胞中是miR-27a-3p的靶點(diǎn)

通過ENCORI數(shù)據(jù)庫，確定TNPO1、GCC2、THRB和CASC3為miR-27a-3p的潛在靶點(diǎn)。miR-27a-3p導(dǎo)致EC109細(xì)胞中TNPO1表達(dá)降低(圖7A)。與對照Het-1A細(xì)胞系相比，6個(gè)食管癌細(xì)胞中TNPO1顯著上調(diào)(圖7B)。我們還發(fā)現(xiàn)，GEPIA數(shù)據(jù)庫中182個(gè)食管癌組織中TNPO1的表達(dá)高于286個(gè)鄰近非腫瘤組織(圖7C)。根據(jù)ENCORI數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，TNPO1 3’UTR與miR-27a-3p序列互補(bǔ)(圖7D)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNPO1是miR-27a-3p的直接靶點(diǎn)(圖7E)。MiR-27a-3p模擬物能有效降低TNPO1的表達(dá)水平，而MiR-27a-3p抑制劑能顯著增強(qiáng)TNPO1的表達(dá)水平(圖7F)。缺氧可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞中TNPO1表達(dá)上調(diào)(圖7G)。PCR結(jié)果顯示，TNPO1在45個(gè)食管癌組織中顯著高表達(dá)(圖7H)。

8）TNPO1過表達(dá)挽救了沉默的circBCAR3介導(dǎo)的對食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的抑制

我們設(shè)計(jì)了TNPO1過表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)它有效地拯救了sh-circBCAR3對TNPO1表達(dá)的抑制作用(圖8A)。EdU分析和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，circBCAR3 shRNA降低了細(xì)胞活力和增殖，TNPO1過表達(dá)進(jìn)一步提高了細(xì)胞活力和增殖(圖8B-C)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，TNPO1過表達(dá)挽救了敲低circBCAR3對細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖8D)。圖9顯示，sh-circBCAR3對食管癌細(xì)胞鐵死亡的抑制作用被TNPO1的過表達(dá)所拯救。

9）剪接因子QKI加速了circBCAR3的生物發(fā)生

為了確定circBCAR3形成的調(diào)控機(jī)制，我們針對MEX3A、MEX3B、QKI、ESRP1、ESRP2、NOVA1、NOVA2等剪接因子設(shè)計(jì)shRNAs，檢測轉(zhuǎn)染這些shRNAs后circBCAR3的表達(dá)。PCR分析結(jié)果顯示，剪接因子QKI和ESRP1負(fù)向調(diào)控食管癌細(xì)胞中circBCAR3的表達(dá)，而其他剪接因子對circBCAR3的表達(dá)無明顯影響(圖10A)。接下來，我們揭示了circBCAR3形成BCAR3外顯子的側(cè)翼的5個(gè)QKI結(jié)合序列(圖10B)。使用QKI抗體的RIP實(shí)驗(yàn)表明，QKI在a、b、e和f位點(diǎn)與BCAR3 pre-mRNA結(jié)合(圖10C)。此外，QKI在我們收集的45個(gè)食管癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖10D)。QKI敲低可以抑制circBCAR3的表達(dá)，而對BCAR3 mRNA的表達(dá)沒有影響(圖10E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪接因子QKI通過內(nèi)含子中的結(jié)合位點(diǎn)加速了circBCAR3的生物發(fā)生。

10）缺氧誘導(dǎo)E2F7表達(dá)激活QKI轉(zhuǎn)錄

缺氧如何誘導(dǎo)circBCAR3表達(dá)升高尚不清楚。因此，我們使用RNA-seq來篩選異常基因，如熱圖和火山圖所示(圖11A, B)。富集分析顯示E2F家族的基因被富集(圖11C)。我們通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫來探討這些E2Fs在食管癌中的表達(dá)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)E2F7在食管癌中顯著高表達(dá)(圖11D)。PCR分析證實(shí)，缺氧處理后EC109細(xì)胞中E2F7和QKI表達(dá)均上調(diào)(圖11E)。由于E2F7是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，我們推測E2F7可能調(diào)控QKI的轉(zhuǎn)錄。在QKI的啟動子中，我們基于JASPR在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了一個(gè)E2F7的潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖11F)。隨后，我們將該結(jié)合位點(diǎn)的野生和突變形式亞克隆到pGL3載體中。結(jié)果表明，E2F7對攜帶野生結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告載體熒光素酶活性有促進(jìn)作用，但對突變位點(diǎn)無促進(jìn)作用(圖11G)。此外，E2F7敲除降低了QKI mRNA的表達(dá)水平(圖11H)。我們檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫，在182個(gè)食管癌組織中檢測這些關(guān)鍵分子的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示E2F7與QKI、E2F7與TNPO1、QKI與TNPO1表達(dá)正相關(guān)(圖11I)。

結(jié)論：我們創(chuàng)新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用。在分子水平上，剪接因子QKI促進(jìn)circBCAR3的生物發(fā)生，通過與miR-27a-3p結(jié)合上調(diào)TNPO1，加速食管癌的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)表明，circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：Xi Y, Shen Y, Wu D, Zhang J, Lin C, Wang L, Yu C, Yu B, Shen W. CircBCAR3 accelerates esophageal cancer tumorigenesis and metastasis via sponging miR-27a-3p. Mol Cancer. 2022 Jul 15;21(1):145. doi: 10.1186/s12943-022-01615-8.