TRIM47加重脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

內(nèi)皮激活在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用，然而，詳細的調(diào)控機制仍不清楚。在這里，我們報道了TRIM47在血管內(nèi)皮細胞中高表達。TRIM47缺陷小鼠通過減輕肺部炎癥，有效抵抗脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）和死亡。在TNFα誘導(dǎo)的體外內(nèi)皮激活過程中TRIM47上調(diào)。內(nèi)皮細胞中TRIM47的敲除抑制多種促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄，減少單核細胞粘附和粘附分子的表達，并抑制內(nèi)皮細胞中IL-1β和IL-6的分泌。相反，在TNFα刺激下，TRIM47的過表達促進炎癥反應(yīng)和單核細胞粘附。此外，TRIM47能夠在內(nèi)皮激活期間激活NF-κB和MAPK信號通路。TRIM47通過促進TNFα信號通路的關(guān)鍵成分TRAF2的K63連接泛素化而導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化?？傊琓RIM47作為一種新型的內(nèi)皮細胞激活劑，通過增強TRAF2的K63連接泛素化，促進LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥和急性肺損傷，進而激活NF-κB和MAPK信號通路，觸發(fā)內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)。本文于2022年5月發(fā)表于“Signal Transduction and Targeted Therapy”（IF=38.104）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）TRIM47在血管內(nèi)皮細胞中高表達

我們首先檢測了TRIM47在小鼠不同組織中的分布和表達。如圖1a所示，免疫組織化學(xué)分析表明，TRIM47在肺、腎小管、心臟和附睪白色脂肪組織（eWAT）中高表達，在腦、胃、皮膚和結(jié)腸中中度表達，在肝臟、睪丸、脾臟和胸腺中低表達。實時PCR和western blot檢測不同組織中TRIM47的mRNA和蛋白水平。與免疫組化結(jié)果一致，TRIM47 mRNA在肺、腎、心臟和eWAT中高表達（圖1b），該蛋白在肺、腎臟、心臟、eWAT和睪丸中豐富（圖1c）。接下來，我們檢測了TRIM47在多種細胞類型中的表達。實時PCR結(jié)果顯示，TRIM47在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）、人臍靜脈細胞系EA.hy926、人大腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3和小鼠大腦微血管內(nèi)皮細胞系bEnd.3中特異表達，但在人單核細胞系THP-1和小鼠巨噬細胞系RAW264.7中觀察到低表達（圖2a）。此外，通過western blot檢測，內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出高水平的TRIM47蛋白（圖2b）。特別是，免疫組化結(jié)果顯示，如箭頭所示，包括肺、腦、結(jié)腸和皮下組織在內(nèi)的多個組織的血管內(nèi)膜中有TRIM47的強烈表達（圖2c）。與其他56個TRIM基因相比，TRIM47分別在HUVEC和hCMEC/D3中表現(xiàn)出適度表達（圖2d，e）。這些結(jié)果表明，TRIM47在多種組織中廣泛表達，并在血管內(nèi)皮細胞中高表達。

2）TRIM47缺乏減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷和肺部炎癥反應(yīng)

為了研究TRIM47對全身炎癥反應(yīng)和器官損傷的影響，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，去除TRIM47基因的所有外顯子，獲得TRIM47全面敲除小鼠(TRIM47- /?)（圖3a）。通過小鼠尾部DNA的RT-PCR分析進一步確認敲除小鼠（圖3b）。通過western blot分析檢查肺組織提取物，結(jié)果表明TRIM47蛋白在純合靶向等位基因中完全被消除（圖3c）。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的休克模型廣泛用于模擬人類感染性休克的癥狀，如全身炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙綜合征和內(nèi)毒素休克。注射LPS 24小時后，TRIM47?/?小鼠的肺水腫減輕（圖3d）。此外，TRIM47缺乏可提高LPS誘導(dǎo)后小鼠的存活率（圖3e）。HE染色顯示正常條件下WT與TRIM47?/?小鼠的肺組織學(xué)無明顯差異。WT小鼠的肺部出現(xiàn)顯著的組織損傷，包括中性粒細胞浸潤、肺泡壁增厚、出血、肺泡水腫和肺泡破裂（圖3f）。TRIM47缺乏顯著減輕了LPS誘導(dǎo)的TRIM47?/?小鼠的組織學(xué)變化。TRIM47?/?小鼠中促炎細胞因子mRNA表達量明顯低于WT小鼠（圖3g），同時，TRIM47缺乏也顯著降低了LPS誘導(dǎo)的小鼠血清IL-1β、IL-6和TNFα水平的升高（圖3h）。這些結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)期間，TRIM47缺乏顯著減輕了急性肺損傷和肺部炎癥。

3）內(nèi)皮細胞炎癥刺激可提高TRIM47的表達

我們建立體外模型以進一步闡明內(nèi)皮TRIM47在炎癥和ALI中的作用。我們首先研究了外源刺激對TRIM47表達的影響。結(jié)果表明，TRIM47的mRNA表達在LPS（圖4a）和H2O2（圖4b）的作用下顯著上調(diào)。自TNFα刺激后2小時起，TRIM47的表達顯著增加，并在12小時達到峰值（圖4c）。TRIM47蛋白水平也因炎癥或氧化應(yīng)激而上調(diào)（圖4d-f）。免疫細胞化學(xué)分析證實TRIM47主要位于HUVEC的細胞核內(nèi)。TNFα刺激1小時后，在胞漿和細胞核中發(fā)現(xiàn)TRIM47的表達增加，并持續(xù)8小時（圖4g）。LPS在1小時和8小時時間點誘導(dǎo)細胞質(zhì)TRIM47熒光增加（圖4h）。此外，通過western blot分別測定TRIM47在細胞質(zhì)和細胞核部分的定位。結(jié)果表明，細胞核中含有顯著比例的TRIM47，其在TNFα刺激下顯著上調(diào)。TNFα刺激后，細胞質(zhì)TRIM47含量也增加（圖4i）。LPS誘導(dǎo)細胞質(zhì)TRIM47略微增加，但在細胞核中沒有顯著變化（圖4j）。總之，TRIM47的表達因炎癥刺激而升高，可能在內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

4）TRIM47促進TNFα誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活化

我們構(gòu)建siRNA和過表達載體，探討TRIM47在TNFα誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞激活中的作用。TIRM47的敲除顯著降低了TNFα誘導(dǎo)的多種粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和MCP-1）的mRNA表達，以及促炎細胞因子（如TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8）在HUVEC中的表達（圖5a）。相反，TRIM47的過表達顯著增強了這些分子的mRNA水平（圖5b）。Western blot結(jié)果表明，敲除TRIM47顯著抑制TNFα誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的表達（圖5c），而TRIM47過表達促進了這些蛋白質(zhì)的表達（見圖5d）。TRIM47對粘附分子表達的影響在野生型和TRIM47-KO小鼠的肺微血管內(nèi)皮細胞中得到進一步證實。正如所料，TNFα誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的升高在TRIM47缺陷的肺微血管內(nèi)皮細胞中被顯著抑制（圖5e）。此外，TRIM47的敲除顯著降低了TNFα誘導(dǎo)的THP-1細胞對HUVECs的粘附，但過表達TRIM47則有相反的效果(圖5f)。TRIM47的敲除也抑制了TNFα誘導(dǎo)的促炎細胞因子IL-1β和IL-6的分泌。相比之下，過表達TRIM47促進了TNFα誘導(dǎo)的促炎細胞因子的產(chǎn)生(圖5g)。這些結(jié)果表明，TRIM47是TNFα誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞激活的調(diào)節(jié)因子。

5）TRIM47激活NF-κB和MAPK促炎信號通路

我們研究了包括NF-κB和MAPK在內(nèi)的潛在信號通路在TRIM47介導(dǎo)的內(nèi)皮激活中的作用。結(jié)果表明，TRIM47的敲除顯著抑制IκBα、IKKα/β和p65亞單位的磷酸化，并阻止IκBα的降解（圖6a），而TRIM47過表達促進了NF-κB信號通路的激活（圖6b）。TRIM47敲除抑制JNK和p38 MAPK信號通路的激活，但對ERK沒有明顯影響（圖6c）。TNFα誘導(dǎo)后，TRIM47過表達進一步激活JNK和p38信號通路（圖6d）。這些結(jié)果表明，TRIM47介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞激活可能與NF-κB和MAPK信號通路的激活有關(guān)。

6）TRIM47促進K63連接的TRAF2泛素化

新的證據(jù)表明，TRIM蛋白介導(dǎo)K48或K63連接泛素化，激活NF-κB信號通路，以響應(yīng)外源性刺激。因此，我們分析了參與內(nèi)皮激活的TRIM47泛素化模式。結(jié)果表明，TRIM47的過表達明顯增強了K63連接的泛素化，而不是K48（圖7a）。TRAF2是TNFR信號復(fù)合物中的關(guān)鍵銜接分子，促進下游信號級聯(lián)，如NF-κB和MAPK激活，而TRAF6是IL-1受體/TLR信號的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)子。據(jù)報道，K63連接的多泛素鏈可以連接到TRAF2，作為招募TAK1、TAB1和TAB2的支架?；钚訲AK1進一步磷酸化MAPK和IKK復(fù)合物，以啟動MAPK和NF-κB級聯(lián)。因此，我們檢測了參與該信號通路的TRIM47的可能結(jié)合蛋白。如圖7b所示，TRIM47與TRAF2而非TRAF6結(jié)合。TRIM47不與下游蛋白TAK1、IKKγ和IκBα發(fā)生相互作用。用TRIM47和TRAF2抗體進行的共免疫沉淀分析進一步證實內(nèi)源性TRIM47與TFAF2參與了HUVECs中K63連接的泛素化（圖7c，d）。這些結(jié)果表明，TRIM47可能通過增強TRAF2的K63連接泛素化來調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK的激活。

結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)TRIM47是一種新型的內(nèi)皮細胞激活劑，在ALI期間，它通過激活內(nèi)皮細胞TRAF2-MAPK/NF-κB促炎軸介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并促進炎癥和組織損傷。TRIM47可能是內(nèi)皮炎癥和ALI藥物開發(fā)的一個有吸引力的靶點。

參考文獻：

Qian Y, Wang Z, Lin H, Lei T, Zhou Z, Huang W, Wu X, Zuo L, Wu J, Liu Y, Wang LF, Guan XH, Deng KY, Fu M, Xin HB. TRIM47 is a novel endothelial activation factor that aggravates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via K63-linked ubiquitination of TRAF2. Signal Transduct Target Ther. 2022 May 6;7(1):148. doi: 10.1038/s41392-022-00953-9.