建立基于腫瘤浸潤免疫細(xì)胞程度和分子分型的肺鱗癌免疫治療療效預(yù)測模型

近日，有研究基于腫瘤浸潤免疫細(xì)胞程度和分子分型，建立了一種肺鱗癌免疫治療療效預(yù)測模型，該研究發(fā)表在《Journal of Translational Medicine》，IF: 8.44。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. NMF分型將training set分為低免疫細(xì)胞浸潤型和高免疫細(xì)胞浸潤型

以TCGA數(shù)據(jù)庫中501例肺鱗癌（LUSC）患者的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，根據(jù)單樣本基因集富集分析（GSEA）評估的瘤浸潤免疫細(xì)胞（TIICs）程度，采用非負(fù)矩陣分解（NMF）進(jìn)行分組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rank值為2-3時，遺傳分型指數(shù)下降幅度最大（圖1A）。因此，選擇秩值2，將患者分為低免疫細(xì)胞浸潤型（cluster 1：C1）和高免疫細(xì)胞浸潤型（cluster 1：C2）。熱圖還顯示，當(dāng)類型數(shù)量限制在兩種時，training set的樣本可以很好地區(qū)分（圖1B）。此外， tSNE降維（圖1C）和 PCA（圖1D）表明，C1和C2具有較好的識別能力，表明該分類方法的可行性。在C1和C2患者中，執(zhí)行抗腫瘤免疫和執(zhí)行促腫瘤免疫的細(xì)胞類型得分均存在顯著正相關(guān)（圖1E），C1患者的相關(guān)系數(shù)為0.86 （P=1.2e?56），C2患者的相關(guān)系數(shù)為0.83 （P=2.8e?82）。C2患者的抗腫瘤免疫（p<0.0001）和促腫瘤免疫（p<0.0001）富集評分顯著高于C1患者（圖1F）。此外，28種免疫細(xì)胞的富集分?jǐn)?shù)存在顯著差異，其中C1型顯著低于C2型（圖1G）。這些結(jié)果提示LUSC的C1型可視為低免疫細(xì)胞浸潤的“冷腫瘤”，而C2型則傾向于高免疫細(xì)胞浸潤的“熱腫瘤”。這些結(jié)果表明，NMF分型對training set中的免疫細(xì)胞浸潤程度有較強(qiáng)的區(qū)分能力。

圖1 NMF分型將訓(xùn)練集分為低免疫細(xì)胞浸潤型和高免疫細(xì)胞浸潤型

2. NMF分型的臨床病理特征

根據(jù)NMF分型，對training set中患者的幾個重要臨床病理特征進(jìn)行了差異分析，包括年齡、性別、TNM分期和臨床分期。結(jié)果僅顯示兩種亞型在性別上有顯著差異。C1型患者中女性36例（7.19%），顯著低于C2型患者94例（18.76%）（P=0.0112）。各亞型間的其他臨床病理特征如年齡和分期無差異（表1）。隨后的生存分析顯示，兩種亞型間LUSC患者的OS （P=0.74，圖2A）和DFS （P=0.5，圖2B）均無顯著差異。

3. NMF類型間的DEGs主要參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)

通過差異分析，與C2型相比，C1型中有468個基因顯著上調(diào)，2179個基因顯著下調(diào)（圖2C）。GO富集分析顯示，DEGs主要富集于以下生物過程:免疫系統(tǒng)過程（48.50%）、免疫應(yīng)答（42.02%）、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程（27.84%）等（圖2D）。從細(xì)胞成分來看，主要富集在胞外區(qū)（37.87%）、膜內(nèi)成分（15.40%）和膜內(nèi)成分（14.78%）等（圖2E）。而在分子功能方面，這些基因主要富集在信號受體活性（16.61%）、分子換能器活性（16.61%）和信號受體結(jié)合（15.25%）等方面（圖2F）。KEGG富集分析顯示，DEGs主要參與細(xì)胞因子受體相互作用（12.75%）、趨化因子信號通路（8.55%）、病毒蛋白、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體相互作用（7.46%）等途徑（圖2G）。

圖2 NMF類型間差異表達(dá)基因（DEGs）主要參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)

4. 構(gòu)建17個基因的免疫浸潤預(yù)測模型

雖然NMF分型能較好地區(qū)分TIICs的豐度，但不能預(yù)測患者的生存預(yù)后。因此，需要在此前提下建立新的預(yù)測模型。取DEGs、影響患者OS和DFS的基因和兩個驗證集測序的基因（圖3A）這5個基因集的交集，共得到20個基因用于構(gòu)建預(yù)測模型（圖3A）。通過LASSO回歸，共篩選出17個具有回歸系數(shù)的基因（圖3B）。另外，從圖3C可以看出，在考慮調(diào)優(yōu)參數(shù)的最小值（λ）時，模型曲線下的ROC 面積 （AUC）值較大。通過構(gòu)建nomogram預(yù)測模型對C2型患者的預(yù)測效果可視化（圖3D）。當(dāng)IPTS=0.6369時，C1型和C2型患者患病的概率均為50%，且當(dāng)IPTS值超過0.6369時，C2型患者患病的概率更高。此外，在1000次重復(fù)條件下，校準(zhǔn)曲線（圖3E）的平均絕對誤差（MAE）為0.062，曲線擬合良好，預(yù)測效果良好。由該模型可以看出，回歸系數(shù)< 0的基因共有9個，可以作為C1型的基因簽名；8個回歸系數(shù) > 0的基因可作為C2型的基因標(biāo)記（圖3F），從而在一定程度上實現(xiàn)了分子分型。

圖3構(gòu)建基于17個基因的免疫浸潤預(yù)測模型

5. 基于IPTS預(yù)測模型的分子分型可替代NMF分型

通過分析并繪制ROC曲線，AUC為0.82 （95% CI= 0.86-0.79）（圖4A），最大約登指數(shù)對應(yīng)的截斷值在nomogram中預(yù)測概率為50%，即0.6369。此時ROC曲線預(yù)測敏感性為0.8038，特異性為0.7189，提示IPTS模型能較好預(yù)測LUSC患者的NMF分型。C2型患者IPTS顯著高于C1型患者（P=0.0026，圖4B）， C2型患者IPTS高于C1型患者數(shù)量顯著高于C1型患者（P<0.0001,表1）。初步認(rèn)為基于IPTS的分子分型可以很好地預(yù)測NMF分型。為了進(jìn)一步明確IPTS亞型分型是否可以替代NMF分型，還進(jìn)行了差異分析和相關(guān)分析。如圖4C所示，高IPTS患者的抗腫瘤免疫（P<0.0001）和促腫瘤免疫（P<0.0001）富集分?jǐn)?shù)顯著高于低IPTS患者。此外，在高IPTS組和低IPTS組中，抗腫瘤免疫和促腫瘤免疫的富集分?jǐn)?shù)之間均存在顯著相關(guān)性（圖4D）。高分組相關(guān)系數(shù)為0.86 （P=5.1e?89），低分組相關(guān)系數(shù)為0.90 （P=1.8e?73）。此外，除CD56 bright NK細(xì)胞外（P=0.07），高IPTS組TIICs的富集分?jǐn)?shù)顯著高于低IPTS組（P <0.0001，圖4E）。因此，基于IPTS的分子分型可替代NMF分型，具有潛在的臨床應(yīng)用治療價值。由于預(yù)測模型是基于影響患者OS和DFS的基因構(gòu)建的，因此通過生存分析來評估該模型的預(yù)后預(yù)測價值。此外，作者又評估了該模型是否能夠彌補(bǔ)NMF分型缺失的預(yù)后預(yù)測功能。結(jié)果顯示，當(dāng)以最優(yōu)截斷值代替ROC曲線的截斷值時，低IPTS組的OS （HR=1.06, 95% CI= 0.98-1.16, P=0.03，圖4F）和DFS （HR=1.12, 95% CI= 1.03-1.20, P=0.0027，圖4G）均優(yōu)于高IPTS組。該預(yù)測模型能在一定條件下預(yù)測患者的預(yù)后。

圖4基于IPTS預(yù)測模型的分子分型可替代NMF分型

6. 免疫浸潤預(yù)測模型預(yù)測免疫治療的免疫療效和5種抗腫瘤藥物的潛在治療價值

在接受抗PD-1抗體免疫治療的NSCLC隊列（GSE126044）中，對免疫治療有反應(yīng)的患者的IPTS明顯高于對免疫治療無反應(yīng)的患者（P=0.0032）（圖5A），ROC曲線下面積為0.95 （95% CI= 1.00-0.84），而PD-L1的ROC曲線下面積為0.73 （95% CI= 0.99-0.46，圖5D），表明在本數(shù)據(jù)集中，IPTS對免疫治療的療效有很大的預(yù)測作用。在另一個NSCLC隊列（GSE135222）中，受益于免疫治療的患者IPTS高于未受益于免疫治療的患者（P=0.0451）（圖5B）， ROC曲線下面積為0.77 （95% CI= 0.96-0.58），也大于PD-L1的0.69 （95% CI= 0.90-0.48，圖5E），提示IPTS對該隊列的免疫治療療效具有良好的預(yù)測價值。此外，該數(shù)據(jù)集報告了患者PFS的預(yù)后信息。取最佳截斷值（IPTS=?2.13），高IPTS患者免疫治療后的PFS優(yōu)于低IPTS患者（HR=0.72, 95% CI= 0.5-1.04, P=0.0059，圖5G），也表明免疫治療療效有較好的預(yù)測價值，對生存預(yù)后有一定的預(yù)測價值。有反應(yīng)組患者的IPTSE明顯高于無反應(yīng)組（P=0.0325）（圖5C）， ROC曲線下面積為0.88 （95% CI= 1.00-0.66），大于PD-L1的0.64 （95% CI= 1.00-0.26，圖5F）。取最佳截斷值（IPTS=?4.05），高IPTS患者經(jīng)免疫治療后的PFS優(yōu)于低IPTS患者（P=0.0403，圖5H）。由此可以證實，所構(gòu)建的免疫浸潤預(yù)測模型對免疫療效具有預(yù)測價值，即高IPTS患者的免疫治療效果可能更好。

從上述分析來看，低IPTS患者不太可能從免疫治療中獲益。對于這一亞型的患者，作者通過GDSC數(shù)據(jù)庫初步篩選了其他可能有療效的抗腫瘤藥物。分析結(jié)果顯示，在LUSC細(xì)胞系中，高IPTS組的acetalax （P=0.0168）、AZD2014 （P=0.0416）、GSK2606414 （P=0.0145）、obatoclax mesylate （P=0.0061）、VSP34_8731 （P=0.0163） 5種抗腫瘤藥物的IC50均高于低IPTS組（圖5I）。此外，從熱圖（圖5J）可以看出，高IPTS組的IC50值普遍高于低IPTS組，說明低IPTS組患者對這五種藥物可能更為敏感。

圖5免疫浸潤預(yù)測模型預(yù)測免疫治療相對于5種抗腫瘤藥物的免疫療效

7. IPTS與免疫微環(huán)境評分和免疫相關(guān)基因特征表達(dá)呈正相關(guān)

采用IPTS分子分型分組分析法評估訓(xùn)練集中501例LUSC患者的免疫微環(huán)境評分。結(jié)果顯示，高IPTS組間質(zhì)評分（p0.0001）、免疫評分（p0.0001）和ESTIMATE評分（p0.0001）均顯著高于低IPTS組（圖6A），提示高IPTS組間質(zhì)細(xì)胞水平和免疫細(xì)胞浸潤水平高于低IPTS組。同時，IPTS分子分型相關(guān)分析顯示，只有免疫評分在低IPTS組中具有統(tǒng)計學(xué)意義，基質(zhì)評分和ESTIMATE評分在低IPTS組無顯著差異，提示三種免疫微環(huán)境評分在高IPTS組中主要與IPTS呈正相關(guān)。IPTS分子分型分析結(jié)果顯示，高IPTS組的趨化因子、受體、MHC分子、免疫抑制劑、免疫刺激因子富集分?jǐn)?shù)明顯高于低IPTS組（圖6B）。分析四種免疫抑制劑CTLA-4、PD-1 （PDCD1）及其兩種配體PD-L1 （CD274）和PDL-2 （PDCD1LG2）在訓(xùn)練集中IPTS組間表達(dá)值的差異。結(jié)果顯示，CTLA-4、PD-1、PD-L2在高IPTS組表達(dá)明顯高于低IPTS組，PD-L1表達(dá)不顯著（P=0.22）（圖6C）。IPTS分子分型相關(guān)分析結(jié)果顯示，在低評分組PD-1表達(dá)與IPTS呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6H），而其他三種免疫抑制劑的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)意義。在高評分組，四種免疫抑制劑CTLA-4、 PD-1、PD-L1、PD-L2與IPTS呈正相關(guān)（圖6G-J）。上述結(jié)果在一定程度上進(jìn)一步為高IPTS患者獲得更好的免疫治療效果提供了理論依據(jù)。

圖6 IPTS與免疫微環(huán)境評分和免疫相關(guān)基因簽名表達(dá)呈正相關(guān)

8. 高IPTS參與免疫相關(guān)信號通路

GSEA結(jié)果顯示，IPTS主要與帕金森病、氧化磷酸化、亨廷頓病、阿爾茨海默病、剪接體、同源重組、核苷酸切除修復(fù)等相關(guān)（圖7A）。相反，高IPTS主要與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、利什曼原蟲感染、細(xì)胞粘附分子、JAT - STAT信號通路等有關(guān)（圖7B）。這些結(jié)果表明，低IPTS主要參與疾病、遺傳和代謝相關(guān)信號通路，而高IPTS主要參與免疫相關(guān)信號通路。

圖7高IPTS參與免疫相關(guān)信號通路

結(jié)論：

綜上所述，基于TCGA數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了包含17個基因的LUSC患者免疫治療效果預(yù)測模型。在GEO數(shù)據(jù)庫的兩個獨立隊列中驗證了該模型的預(yù)測效果。IPTS分子分型與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)，與免疫治療療效呈正相關(guān)，具有潛在的預(yù)后價值。該研究為預(yù)測LUSC免疫治療的療效提供了一種新的方法，具有潛在的臨床前景.

參考文獻(xiàn)：

Yang L, Wei S, Zhang J, Hu Q, Hu W, Cao M, Zhang L, Wang Y, Wang P, Wang K. Construction of a predictive model for immunotherapy efficacy in lung squamous cell carcinoma based on the degree of tumor-infiltrating immune cells and molecular typing. J Transl Med. 2022; 20（1）:364. doi: 10.1186/s12967-022-03565-7.