新的長讀轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)“JAFFAL”被應(yīng)用——可以檢測融合基因

在癌癥中，融合是重要的診斷標(biāo)志物和治療靶點。長讀轉(zhuǎn)錄組測序可以發(fā)現(xiàn)全長亞型結(jié)構(gòu)的融合。然而，由于較高的測序錯誤率，專為短讀設(shè)計的融合查找算法并不奏效。在這里，作者介紹了JAFFAL，從長讀轉(zhuǎn)錄組測序中識別融合。之后使用模擬、細胞系和來自Nanopore和PacBio的患者數(shù)據(jù)來驗證JAFFAL。最終將JAFFAL應(yīng)用到單細胞數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)跨越三個基因的融合，證明從復(fù)雜重排中檢測到的轉(zhuǎn)錄本。JAFFAL可在https://github.com/Oshlack/JAFFA/wiki獲得。該研究于2022年1月發(fā)表于《Genome Biology》，IF：10.806。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. JAFFAL管道

如圖1，JAFFAL是一種新的多級管道，使用bpipe編寫，其動機來自于作者從JAFFA的Direct模式中獲得的方法。該流程包括以下步驟：(1)首先使用噪聲耐受的長讀對齊器minimap2將長讀序列與參考轉(zhuǎn)錄組(hg38 gencode version 22)對齊，檢測融合。(2)選擇與融合基因一致的Reads，即與不同基因?qū)R的片段進行分析。(3)隨后與參考基因組hg38對齊，同樣使用minimap2。刪除參考基因組比對后沒有跨越多個基因的Reads。(4)JAFFAL利用參考基因組比對的末端位置來確定融合斷點。(5)斷點被分為“High Confidence”，“Low Confidence”和“Potential Trans-Splicing”。

圖1. 融合檢測的JAFFAL管道步驟

2. JAFFAL融合排序在分離非腫瘤數(shù)據(jù)中的假陽性方面是有效的

為評估JAFFAL在不同分類水平和不同測序方案的真實數(shù)據(jù)上的假陽性率，將Nanopore WGS產(chǎn)生的參考細胞系NA12878進行ONT融合，并稱之為Direct RNA和Amplified cDNA測序。由于這是非腫瘤細胞系，融合應(yīng)該很少，幾乎所有報道的融合都是假陽性。如表1，對于兩種方案，JAFFAL報告了很少的融合，與預(yù)期的High confidence排名。在cDNA數(shù)據(jù)中，LongGF報道了173個融合Multi-read support，JAFFAL只稱8次融合為High confidence。相反，在JAFFAL對cDNA數(shù)據(jù)的Low confidence水平下報道了過多的融合(報道了94個融合)，而這種過量在Direct RNA數(shù)據(jù)中未見(報告了5例融合)。綜上所述，模擬和非腫瘤細胞系數(shù)據(jù)表明，被JAFFAL分類為High confidence的假陽性率較低。

表1. 從ONT直接RNA和擴增cDNA中提取非腫瘤細胞系NA12878的融合基因和斷點數(shù)量

3. 利用JAFFAL可以在有噪聲的長讀取數(shù)據(jù)中準確地檢測出模擬的融合

為模擬真實的背景，將模擬的ONT讀取量與NA12878的2500萬個cDNA讀取量相結(jié)合。JAFFAL在無背景的ONT仿真、無背景的PacBio仿真和有背景的ONT仿真三個數(shù)據(jù)集上具有相似的融合發(fā)現(xiàn)靈敏度。JAFFAL檢測到98%的模擬融合，當(dāng)讀取身份為90%或以上，覆蓋率為10或以上(圖2A)。在后臺讀取NA12878的情況下，JAFFAL的敏感性高于LongGF(圖2B)。因此，利用JAFFAL可以在有噪聲的長讀取數(shù)據(jù)中準確地檢測出模擬的融合。

圖2. 具有背景的模擬ONT數(shù)據(jù)的融合發(fā)現(xiàn)靈敏度

4. JAFFAL檢測癌細胞系中已知的融合

為進一步證實JAFFAL的準確性，將其應(yīng)用于6個癌癥細胞系的公開長讀轉(zhuǎn)錄組測序，融合之前已經(jīng)使用RT-PCR和Sanger測序進行驗證，或者有來自全基因組測序的正交證據(jù)表明發(fā)生了易位。JAFFAL重新發(fā)現(xiàn)了大約一半之前驗證過的融合基因(表2)。相比LongGF，JAFFAL報告了所有數(shù)據(jù)集中相同或更多先前驗證過的融合，并將其排名更高(圖3A和B，表2)。僅MCF-7而言，JAFFAL之前在長讀上驗證的融合和報告的其他融合的數(shù)量都在短讀重復(fù)的范圍內(nèi)，這更普遍地證明了JAFFAL的準確性和帶噪聲的長讀數(shù)據(jù)在融合檢測中的效用(圖3C)?？偟膩碚f，在MCF-7 ONT細胞系數(shù)據(jù)上，JAFFAL的High confidence和Low confidence調(diào)用與之前驗證的融合、匹配的短讀數(shù)據(jù)中的融合以及LongGF調(diào)用的融合顯示了一致性(圖3D)。綜合來看，這些結(jié)果表明JAFFAL是高度準確的，特別是在High confidence類別。

表2. JAFFAL和LongGF在7個長讀測序數(shù)據(jù)集中重新發(fā)現(xiàn)了之前驗證過的融合的數(shù)量

圖3. JAFFAL和LongGF對癌細胞測序的比較

5. 用長讀測序檢測白血病中臨床相關(guān)融合

接下來，將JAFFAL應(yīng)用于兩份來自白血病患者的樣本，以評估其在現(xiàn)實環(huán)境中檢測融合的能力。1例患者患有急性髓系白血病(AML)伴RUNX1-RUNX1T1融合。另一個病人患有B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)，罕見的BCR-ABL1和IGH-CRLF2融合現(xiàn)象。JAFFAL檢測到RUNX1-RUNX1T1和BCR-ABL1融合在他們各自的樣本中17個和51個High confidence調(diào)用中排名第一和第五。與模擬和細胞系數(shù)據(jù)的結(jié)果一致，JAFFAL找到了確切的斷點。

6. 單細胞水平的融合檢測

利用長讀測序的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)正在成為一種研究跨細胞類型轉(zhuǎn)錄多樣性的強大系統(tǒng)。為證明在單細胞水平上調(diào)用融合的可行性，將JAFFAL應(yīng)用于5個癌癥細胞系混合樣本的公開數(shù)據(jù)，這些樣本使用ONT與10x Genomics和Illumina測序相結(jié)合進行測序。在557個細胞中，總共有1800萬個ONT讀取可以分配細胞條形碼。正如預(yù)期的那樣，根據(jù)短讀數(shù)據(jù)中的基因表達，細胞聚集成五個不同的組(圖4A)。在融合中，13例也出現(xiàn)在短讀RNA測序中作為癌癥細胞系百科全書CCLE的相同細胞系的一部分(圖4B)。不同的融合集與每一個集群相關(guān)聯(lián)，使集群注釋到每一個細胞系(圖4A)。一個融合，RP11-96H19.1-RP11-446 N19.1在所有五個集群中都可以看到。它不存在于CCLE中，與參考基因組中相隔264 kbp的組成基因的read-through轉(zhuǎn)錄一致(圖4B)。在錯誤的細胞系簇中檢測到一些融合(圖4A)。然而，盡管有錯誤，這些結(jié)果表明JAFFAL能夠在單個細胞水平上檢測到融合。

7. JAFFAL檢測到三種基因融合

JAFFAL發(fā)現(xiàn)的High confidence的三基因融合之一是在H838細胞系的單細胞測序的BMPR2-TYW5-ALS2CR11。這是由于2號染色體上2.5-Mbp區(qū)域的復(fù)雜重排導(dǎo)致的，并由CCLE全基因組測序發(fā)現(xiàn)的易位支持(圖4C)。長讀連接6個單元中的BMPR2-TYW5和TYW5-ALS2CR11斷點。在46個細胞中，還發(fā)現(xiàn)了另一種截斷的轉(zhuǎn)錄本，它將BMPR2-TYW5斷點與TYW5中一個新的外顯子擴展事件聯(lián)系起來(圖4C)?？傊?，作者鑒定了BMPR2-TYW5-ALS2CR11融合基因的6個不同亞型(圖4C)。

圖4. 5株細胞系ONT測序中融合的檢測

8. 計算資源

JAFFAL和LongGF所需的計算資源在一臺擁有32 cores和190 GB可用內(nèi)存的機器上進行了基準測試。JAFFAL在之前描述的9個健康和癌癥細胞系批量數(shù)據(jù)集上分別用了不到6 h和21 GB內(nèi)存完成(表3)。這些結(jié)果表明，大的長讀序列的融合調(diào)用不太可能受到計算限制使用融合探測器。

表3. JAFFAL和LongGF在9個基準數(shù)據(jù)集上消耗的運行和內(nèi)存的平均值和范圍(括號內(nèi))

結(jié)論：

與短讀相比，長讀測序有許多新的優(yōu)勢。一項令人興奮的發(fā)展是將長讀測序技術(shù)與單細胞RNA測序技術(shù)結(jié)合使用，可以對單個細胞的全部轉(zhuǎn)錄組進行測序。在這里，作者證明融合可以在這些數(shù)據(jù)中被調(diào)用，為單細胞分析增加了一種額外的方式，為研究腫瘤的異質(zhì)性提供了許多新的機會。