熱門技術單細胞RNA測序解碼透明細胞腎細胞癌中腔靜脈瘤栓的多細胞生態(tài)系統

2020 年全球新診斷腎癌病例超過431280例，其中最常見的組織學亞型是透明細胞腎細胞癌 (ccRCC)，約占所有腎細胞癌 (RCC) 病例的 70-80%。RCC 的一個獨特臨床方面是它可以通過腎靜脈侵入下腔靜脈 (IVC)，甚至長到右心腔。大約 15% 的RCC患者報告了腎靜脈或下腔靜脈中的靜脈腫瘤血栓 (TT)。腫瘤血栓水平不一定影響疾病特異性生存，但對手術的復雜性有重大影響，具有顯著的出血風險、不穩(wěn)定的血流動力學和死亡。新輔助全身治療可能潛在地降低 TT 負擔，從而提高腫瘤血栓切除術的安全性和可行性，從而潛在地提高手術切除的治愈潛力。然而，對 TT 形成的潛在機制知之甚少，這阻礙了設計有效的新輔助療法來降低腫瘤血栓的分期和降低血栓切除術的圍手術期發(fā)病率和死亡率。

今天我們介紹一篇關于腎癌靜脈腫瘤血栓單細胞測序的文章，該文章發(fā)表于Genome biology期刊，IF=17.9。改文章利用單細胞RNA測序解碼透明細胞腎細胞癌中腔靜脈瘤栓的多細胞生態(tài)系統，探索腔靜脈瘤栓的形成機制。

腫瘤血栓和匹配的原發(fā)性腫瘤中腫瘤生態(tài)系統的 scRNA-seq 分析

為了闡明靜脈腫瘤血栓中的腫瘤生態(tài)系統，我們從未接受治療的 ccRCC 患者（ccRCC，n ?= 8）收集了19個手術組織標本用于scRNA-seq。腫瘤血栓（n ?= 8）、成對的原發(fā)性腫瘤（n ?= 8）和鄰近腎組織（n ?= 3）分別稱為 TT、PT 和 ART。此外，還納入了4個不同的RNA-seq 數據以進行進一步驗證。從140805個細胞中獲得了大約10億個獨特的轉錄本：62035個細胞來自TT，58695 個細胞來自 PT，20075個細胞來自ART。根據典型基因標記的表達，識別并可視化了 9 種主要細胞類型：上皮細胞、T 細胞、自然殺傷 (NK) 細胞、骨髓細胞、肌成纖維細胞、內皮細胞 (EC)、B 細胞、漿細胞和肥大細胞。我們的結果揭示了 ART、PT 和 TT 樣本之間生態(tài)系統組成的顯著異質性。

與原發(fā)性腫瘤相比，T/NK 細胞聚集和狀態(tài)分析確定腫瘤血栓富含組織駐留 CD8+T細胞，處于祖細胞耗盡狀態(tài)

考慮到研究觀察到免疫檢查點（ICB）治療后 ccRCC 患者的腫瘤血栓顯著減少，我們推測腫瘤浸潤性免疫細胞可能在該過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們首先對 T 和 NK 細胞進行了無監(jiān)督聚類，并在 ART、PT 和 TT 中獲得了12個簇，包括 CD4+ T 細胞的四個亞型，CD8 + T 細胞的五個亞型，兩個NK亞簇和一個 NKT 簇。

為了確定 ARTs、PTs 和 TTs 之間的差異，我們計算了 ARTs、PTs 和 TTs 中每個簇的百分比，發(fā)現 PTs 中幼稚 CD4 + T 細胞 (CD4-C1) 的相對百分比低于ARTs 和 TTs，抑制性 Tregs（CD4-C4）的比例更高，表明 PT 中可能存在更多的免疫抑制狀態(tài)。

雖然在正常腎臟組織中發(fā)現了大量的組織駐留 CD8 + T 細胞，但其機制仍然很大程度上未知。與我們的發(fā)現一致，另一項關于肝細胞癌 (HCC) 的研究也揭示了組織駐留的CD8 + T 細胞在鄰近的非腫瘤組織中比在腫瘤中更豐富。此外，正如之前在 ccRCC [ 36 ] 中觀察到的，耗盡的 CD8 + T 細胞（CD8-C3）在腫瘤組織中的比例增加，但 PT 和 TT 之間沒有顯著差異，表明 CD8 + T 細胞在 PT 和 TT 中均已耗盡。在時間分析中，我們移除了 MAIT 細胞，因為它們具有不同的 TCR 特征。CD8-C1 到 C4 的連續(xù)發(fā)展軌跡代表了一個二元分支結構：CD8-C1 是根，CD8-C3 和 C4 是兩個分支的結束狀態(tài)，CD8-C2 處于過渡狀態(tài)，在PTs和TTs之間非常相似。從軌跡的通路分析表明，T細胞活化和淋巴細胞分化較早，細胞周期、ATP代謝和缺氧相關通路在CD8 +的終末狀態(tài)高度富集。這些結果表明，CD8 + T 細胞在 PTs 和 TTs 之間具有相同的過渡軌跡，伴隨著功能失調和代謝紊亂，最終在 PTs 和 TTs 中都被耗盡。

有證據表明，某些處于祖細胞衰竭狀態(tài)的CD8 + T細胞可以增強免疫檢查點阻斷（ICB）治療黑色素瘤和腎癌的療效。同時，考慮到一些 ccRCC 患者使用 ICB 治療后 TT 的顯著消退，我們詢問是否有某些我們恢復的 CD8 + T 細胞亞群可能類似于祖細胞耗盡表型。然后，我們根據已發(fā)表的研究對 CD8 + T 細胞亞群的祖細胞和最終耗盡的基因特征進行評分]。我們注意到，CD8-C1 亞簇中的祖細胞耗盡簽名顯著富集，并且最終耗盡簽名明顯低于其他子集。此外，大多數祖細胞耗盡的特征基因在 TT 樣本中的 CD8-C1 細胞中表達上調，這進一步證明了祖細胞耗盡的表型富含TT。此外，我們檢查了一大群具有配對 PT 和 TT大轉錄組的患者，觀察到與 PTs 相比，TTs 中 CD8-C1 亞群的比例顯著增加，并且在 TTs 中，祖細胞耗盡和 CD8-C1 特征評分均上調。確定了 CD8-C1 細胞（組織駐留的 CD8 + T 細胞）及其特征在 TT 中比在 PT 中更豐富，我們接下來檢查了我們發(fā)現的 CD8-C1 細胞是否會對抗 PD-1 治療表現出更好的反應使用來自接受 nivolumab（抗 PD-1）治療的更大規(guī)模 ccRCC 患者（CheckMate 025）的治療前大量 RNA-seq 數據。總的來說，這些結果表明，原發(fā)性 ccRCC 和腫瘤血栓中組織駐留 CD8 + T 細胞的高特征可能是對 ICB 治療反應良好的暗示。

巨噬細胞在腫瘤血栓中表現出增強的 ECM 重塑活性，在原發(fā)性腫瘤中表現出免疫反應性擾動

除了適應性免疫外，先天免疫細胞可能是血管內 TT 快速擴展的第一道屏障，這可能對腫瘤血栓形成和對 ICB 治療的抵抗有重要影響。因此，我們分析了 PT、TT和 ART中 16267 個骨髓細胞的轉錄組。骨髓細胞表現出顯著的異質性，分為 14 個簇。基于典型標記的表達，我們將這些簇注釋為巨噬細胞的六種亞型，單核細胞的兩種亞型（Mono1-Mono2），DCs 的四種（DC1-DC4），中性粒細胞的一種和循環(huán)細胞的一種。與 ART 相比，巨噬細胞在 PT 和 TT 中富集，除了 Macro4 簇。與 ART 相比，PT 和 TT 中的中性粒細胞顯著減少，暗示 PTs 和 TTs 的腫瘤細胞可能逃脫循環(huán)中性粒細胞的清除。為了更好地了解這些骨髓相關人群的作用，我們首先檢查了免疫檢查點和逃避相關的基因表達水平。除中性粒細胞外，幾乎所有這些基因都在骨髓亞群中高度表達。雖然CD274 ( PD - L1 ) 和PDCD1LG2 ( PD - L2 ) 都是PD-1信號傳導介導 T 細胞免疫檢查點的配體，但在所有骨髓亞群中都很少檢測到。這些結果表明，中性粒細胞可能更有效地對抗癌細胞，而其他巨噬細胞、單核細胞和 DC 可能已經被 PT 或 TT 腫瘤細胞影響。

巨噬細胞通常分為兩種典型亞型，促炎 M1 和抗炎 M2。然而，我們無法通過已知的標記基因如CD86、TLR4 (M1) 和CD163和MSR1 (M2) 清楚地區(qū)分 M1 和 M2 巨噬細胞。雖然腫瘤相關巨噬細胞 (TAM) 標志物，以及作為M1/M2 和腫瘤相關巨噬細胞 (TAM) 標志物的CD68和HLA - DRA在每個巨噬細胞亞型中都高度表達，表明它們都是 TAM。有趣的是，我們注意到促炎表型中的基因表達特征顯著富集，例如對干擾素的反應，以及與 TT 相比，PT 的 TAM 中的抗原呈遞途徑。令人驚訝的是，與 TT 相比，PT 中的這些 TAM 還上調了免疫檢查點和逃避標記的表達。因此，PTs 中的 TAMs 表現出促炎和免疫抑制表型，可能有助于腫瘤細胞免疫逃逸。然而，在 TTs 中，我們觀察到與腫瘤進展相關途徑相關的特征評分增加，包括上皮-間質轉化 (EMT)、細胞外結構組織和血管生成?？偟膩碚f，TAM 的復雜性表明 PT 和 TT 之間存在明顯的功能障礙狀態(tài)，PT 中具有更強的免疫抑制表型，并且 TT 中的 ECM 重塑增強。

惡性細胞在腫瘤血栓中表現出增加的 ECM 重塑，在原發(fā)性腫瘤中表現出更強的免疫抑制表型

為了更好地了解可能與免疫細胞一起發(fā)揮作用的癌細胞中活躍的細胞程序，我們接下來試圖確定 PT 和 TT 之間惡性細胞的表達模式。根據一項已發(fā)表的研究，通過使用肌成纖維細胞和內皮細胞作為參考，通過 scRNA-seq 數據推斷的拷貝數變異 (CNV) 檢測證實了腫瘤細胞。除患者 P06 外，8 名患者中有 7 名在 TT 和 PT 之間顯示出相似的 CNV 模式和亞克隆結構，支持先前關于 TT 中有限的附加基因組改變的研究。然后，我們評估了PT和TT之間惡性細胞的轉錄差異。我們總共從 PT 中獲得了15012個惡性上皮細胞，從TT標本中獲得了12078個細胞。由于近端小管細胞已被確定為 ccRCC，然后我們比較了惡性細胞和近端小管細胞的缺氧和血管生成特征，這是導致致癌作用的兩種經典生物狀態(tài)。與先前的研究一致，PT 和 TT 惡性細胞的缺氧和血管生成特征明顯高于來自 ART 的細胞。然后，針對惡性細胞，我們總共獲得了4個簇，每個亞簇中個體患者的比例不同，進一步支持了高度的腫瘤間異質性。為了更好地理解它們的轉錄異質性，我們通過 GSVA Hallmark 分析對四個簇進行了評分，并觀察到每個簇之間的顯著轉錄程序差異。具體來說，簇 1 是最豐富的，其特征是缺氧、糖酵解、氧化磷酸化 (OXPHOS) 增加，以及伴隨的免疫激活和代謝途徑。另一項研究報告了 ccRCC 中糖酵解和 OXPHOS 代謝狀態(tài)的共存，其中 RCC 中的混合表型有助于代謝可塑性，使癌細胞能夠適應各種微環(huán)境。此外，有趣的是，與 TAM 相似，我們觀察到與 TT 相比，PT 中與干擾素-γ (IFN-γ) 反應和抗原呈遞途徑相關的基因富集，免疫檢查點和逃避基因的表達上調。它證明了它們促進免疫逃逸和抑制抗腫瘤免疫反應的能力。而 TT 腫瘤細胞在 ECM 重塑和對金屬離子相關通路的反應中被激活。與這些結果一致，在 PT 中觀察到顯著更高比例的CD274 +惡性細胞，在 TT 中觀察到更多的 COL4A1 + 腫瘤細胞，表明 PTs 中較高的免疫抑制狀態(tài)和 TTs 中 ECM 的動態(tài)重塑。此外，我們發(fā)現經典的鐵死亡抑制基因GPX4在 TTs 中表達上調，這意味著通過調節(jié)GPX4來誘導鐵死亡可能在 TTs 中比在 ccRCC 患者的 PTs 中更有效。總之，在單細胞分辨率下，我們發(fā)現 PT 中的惡性細胞表現出更強的免疫抑制表型，而 TT 中的腫瘤細胞表現出更高的 ECM 重編程狀態(tài)。

內皮細胞代表腫瘤血栓中 ECM 重塑相關通路的上調，高豐度的CCL4 +和NDUFA4L2 +內皮細胞與較差的存活率相關

為了進一步評估可能促進腫瘤血栓在血管內生長和擴展的內皮細胞作用，我們專注于內皮細胞 (EC)，并從 PT、TT和ART。這些細胞被亞簇成六個不同的簇，它們中的每一個都是基于 ECs中的經典表達基因鑒定的，包括腎小球樣 ECs (Endo1: SOST + )、癌癥相關 ECs (Endo2 : NDUFA4L2 + )、動脈 ECs (Endo3: GJA5 + )、ACKR1 + ECs (Endo4: ACKR1 + )、尖端細胞 (Endo6: CXCR4 + )和一個未定義的簇 (Endo5)。此外，我們發(fā)現 TTs 中 Endo2 的比率高于 ARTs 和 PTs，表明與癌癥相關的脈管系統形成可能有助于 TT 在血管內空間中的快速延伸。作為支持，我們通過分析來自具有 30 對 PT 和 TT 的大量患者的大量轉錄組，觀察到 TT 中 Endo2 子集的百分比顯著增加。此外，高水平的 Endo2 基因特征與 TCGA KIRC 隊列中的低生存率顯著相關。有趣的是，與 TAM 和惡性細胞一樣，我們發(fā)現 PT 的 EC 中與干擾素反應和抗原結合途徑相關的表達特征顯著增加，但伴隨著與 PT 和 TT 之間的 EC 子集的免疫抑制相關的基因表達的變化。同時，我們注意到在 Endo2 亞群中，與 TT 相比，PT 中大多數與免疫抑制相關的基因的表達水平上調，表明 PT 中的這些細胞可能處于更免疫抑制狀態(tài). 此外，我們發(fā)現 ECs 在 TTs 中具有增強的 ECM 重塑和細胞增殖活性。因此，這些數據表明，除了 TAM 和 TT 中的癌細胞外，TT 中的內皮細胞可能會修飾 ECM 以促進腫瘤血栓的生長，而針對具有 Endo2 特征的細胞的分子療法可能能夠特異性地降低腔靜脈血栓的階段。

腫瘤-基質相互作用重塑了與存活率低相關的腫瘤血栓中的細胞外基質

鑒于與 PT 相比，活化的 ECM 重塑作為 TT 的巨噬細胞、惡性細胞、EC 和肌成纖維細胞的共同趨勢的觀察結果，我們假設不同的細胞群參與了復雜的串擾。為了識別可能的非細胞自主效應，我們使用 CellPhoneDB 通過已知的受體-配體對識別不同細胞群之間的假定信號傳導。值得注意的是，與 ART 和 PT 相比，ECM 重塑途徑中多個配體-受體對的相互作用在 TT 中更強，并且預測肌成纖維細胞具有與腫瘤細胞和 EC 顯著相互作用的最強信號，無論它們的亞組如何。我們還在驗證隊列中使用 30 對PT和TT大量RNA-seq 數據驗證了這一發(fā)現。與 TT 中基質細胞和其他類型細胞中 ECM 成分及其受體的上調表達一致，與 PT 相比，ECM 組裝特征與 TT 中 CIBERSORTx 估計的肌成纖維細胞分數的相關性更強，支持 ECM 重塑相關通路在 TT 中比在 PT 中更激活。

鑒于肌成纖維細胞與惡性細胞和內皮細胞之間的強相互作用，我們首先檢查了腫瘤細胞是否控制基質肌成纖維細胞的募集。我們發(fā)現了肌成纖維細胞和腫瘤細胞之間的廣泛相互作用。詳細地說，與 PT 相比，腫瘤細胞上調了 COL20A1、COL28A1和TGFB1的表達，以在 TT 中募集更多的肌成纖維細胞。此外，肌成纖維細胞釋放膠原相關基因如COL6A2、COL1A2和COL4A2以促進細胞外基質組裝，并且與 TTs 中肌成纖維細胞的豐度具有更高的相關性。TTs中肌成纖維細胞的相對豐度與腫瘤細胞中上調的細胞外基質重塑相關基因之間的相關性顯著高于PTs。這些數據表明，腫瘤細胞可能通過分泌 ECM 相關成分在 TT 中募集更多的肌成纖維細胞。此外，我們還發(fā)現肌成纖維細胞在 TTs 中比在 PTs 中增強了 ECs 的募集，這可能促進血管生成。此外，在 30 對 PT 和 TT ccRCC 患者的驗證隊列中，TTs 中 ECM 組裝、含膠原的 ECM 和細胞外結構組織的表達特征評分均高于 PTs。因此，我們發(fā)現腫瘤血栓中更強的腫瘤-基質相互作用伴隨著腫瘤細胞和基質細胞中一組特定的 ECM 相關基因和通路的上調表達。

為了進一步研究腫瘤-基質相互作用與患者預后之間的關聯，我們使用顯著的 LR 對定義了兩個相互作用特征評分，以計算 TCGA KIRC 隊列中 ECM 重塑相關相互作用的強度。計算腫瘤細胞與肌成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞之間的腫瘤-基質相互作用評分，而在肌成纖維細胞與腫瘤細胞、內皮細胞和巨噬細胞之間產生基質-腫瘤相互作用評分。值得注意的是，我們發(fā)現更強的腫瘤 - 基質相互作用與較差的生存率相關?？傊[瘤-基質相互作用重塑了與存活率低相關的腫瘤血栓中的細胞外基質。

總之，本研究提供了原發(fā)性腫瘤和腫瘤血栓之間在腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞方面表型異質性的證據。我們的數據可以成為寶貴的資源，有助于更深入地了解與腫瘤血栓相關的機制，并有助于為晚期 ccRCC TT 患者開發(fā)更有效的新輔助分子療法和生物標志物。