聽說過嗎？單細(xì)胞免疫譜——揭示免疫治療新機(jī)制
過敏性鼻炎已成為影響全球的問題。通常只有一種方法可以改善這種疾病，即抗體特異性免疫治療，然而這種治療的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過單細(xì)胞測序（scRNA-Seq）和單細(xì)胞保留庫測序分析（scVDJ-Seq）揭示了該作用的部分機(jī)制為：舌下免疫治療（SLIT）促進(jìn)致病性Th2細(xì)胞上肌蛋白的表達(dá)并抑制Th2細(xì)胞功能。本研究于2022年6月發(fā)表在《Journal of Allergy And Clinical Immunology》IF:13.391期刊上。
技術(shù)路線
主要實驗結(jié)果：
1、CD4+記憶T細(xì)胞的功能亞群和克隆比例
從SLIP治療響應(yīng)良好和較差的患者中獲得SLIT治療前1年和治療后1年的外周血單核細(xì)胞（PBMC）。在用柳杉抗原孵育和刺激后，分離CD3+CD4+ CD45RO+ T細(xì)胞用于scRNA-Seq分析和T細(xì)胞受體（TCR）的scVDJ-Seq分析。將所有高質(zhì)量細(xì)胞的TCR V(D)J數(shù)據(jù)合并，校正讀取深度和線粒體讀取計數(shù)，并進(jìn)行PCA分析。根據(jù)已知轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記基因的表達(dá)水平，在PBMCs CD4+T記憶細(xì)胞中鑒定出7個T細(xì)胞簇（naive、Treg、Th2、T,h17、細(xì)胞毒性CD4、自然殺傷T和干擾素反應(yīng)細(xì)胞）（圖1A），圖1B展示了7個亞群在不同樣本中的分布，圖1C展示了每個亞群的代表性基因表達(dá)（圖1C）。在這些細(xì)胞中，TCR在67.2%-78.5%的細(xì)胞中表達(dá)（圖1D），然而超過1個克隆的CD4+T記憶細(xì)胞在較差響應(yīng)和良好響應(yīng)的患者中分別占32.8%和21.5%，超過5個克隆的CD4+T記憶細(xì)胞在較差響應(yīng)和良好響應(yīng)的患者中分別占10.3%和4.7%。然后，比較T細(xì)胞克隆，這些簇的相對比例展示在UMAP中（圖1E）。隨著克隆數(shù)量的增加，克隆在效應(yīng)細(xì)胞中積累。此外，結(jié)果顯示多克隆T細(xì)胞主要是Th2，Th17，Treg，細(xì)胞毒性CD4細(xì)胞，值得注意的是克隆群體中Th2細(xì)胞亞群最多（圖1F）。
圖1 scRNA-Seq和保留庫分析揭示T細(xì)胞亞群的變化
2、SLIT前和后的T細(xì)胞亞群變化
為了探究T細(xì)胞響應(yīng)，比較了抗柳杉抗原SLIT處理前后的T細(xì)胞亞群。盡管存在較大的個體差異，但如果不按克隆數(shù)分類，對反應(yīng)較差和反應(yīng)較好的T細(xì)胞亞群，在SLIT前和SLIT后都看不到整體T細(xì)胞亞群的一致變化（圖2A-B）。因此，作者重新分析了這些細(xì)胞，將它們分為形成單個克隆的獨特細(xì)胞群和形成多個克隆的克隆群體。觀察到獨特細(xì)胞群和2-5克隆細(xì)胞群在SLIT前后沒有明顯變化，而>5的克隆細(xì)胞群顯示Th2和Treg細(xì)胞只在反應(yīng)良好的患者中擴(kuò)增（圖2C）。
接下來，作者比較了所有患者CDR3區(qū)TRA和TRB的氨基酸序列，以評估在SLIT前后TCR保留庫的改變對抗原特異性的影響?？寺☆l率較高的前7個CDR區(qū)域的T細(xì)胞克隆在SLIT前后的重疊率為60% ~ 80%（圖3A）。此外，如果克隆數(shù)量限制在>5，在SLIT前和后的樣本中，TRA和TRB的CDR區(qū)域都有80%的重疊（圖3B）。
圖3 SLIT前和后的TCR保留庫變化
3、SLIT前和后的Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞的功能性調(diào)節(jié)
由于前問結(jié)果提示，SLIT可誘導(dǎo)Th2和Treg細(xì)胞克隆擴(kuò)增，并具有相同的抗原特異性，因此作者對SLIT后出現(xiàn)克隆擴(kuò)增的Th2和Treg細(xì)胞進(jìn)行免疫譜分析，并進(jìn)行PCA分析以提高分辨度并重新評估免疫譜（圖4A）。結(jié)果顯示，根據(jù)IL-5、IL-13、PTGDR2 (CRTH2)、KLRB1 (CD161)的表達(dá)，Th2細(xì)胞可分為2個簇：一個高功能的Tpath2細(xì)胞群和一個功能受損的Th2細(xì)胞群（Trans Th2）（圖4B）。接下來，進(jìn)行軌跡分析，以確定這些細(xì)胞群的分化途徑，并根據(jù)基因表達(dá)譜的相似性評估假時間，發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞中存在由Tpath2細(xì)胞向Trans Th2細(xì)胞分化的軌跡（圖4C），同時在Trans Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞群之間有連續(xù)的中間細(xì)胞，表明Trans Th2細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化。此外，通過對這些SLIT前后的TCR克隆細(xì)胞群比較，發(fā)現(xiàn)對反應(yīng)良好的多克隆細(xì)胞，尤其是>5克隆中，SLIT處理后，Treg細(xì)胞和Trans Th2細(xì)胞以及Tpath2細(xì)胞的克隆擴(kuò)增減少（圖4D-4E）。這些結(jié)果暗示了Trans Th2細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)分化為Treg細(xì)胞的可能性。
圖4 SLIT前和后的Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞的功能性調(diào)節(jié)
4、從Th2細(xì)胞到Treg細(xì)胞的遺傳漂移
接下來，全面比較了每個細(xì)胞群體的基因表達(dá)譜，以尋找促進(jìn)Trans Th2細(xì)胞介導(dǎo)向Treg細(xì)胞分化和SLIT后免疫耐受的功能分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Tpath2細(xì)胞相比，在Trans Th2細(xì)胞中，抑制Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的轉(zhuǎn)錄因子musculin（MSC）和T細(xì)胞遷移抑制受體LPAR6的表達(dá)高度上調(diào)（圖5A）。在Trans Th2細(xì)胞中，MSC在分化軌跡末端也有高特異性表達(dá)（圖5B）。Trans Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比較顯示，Treg細(xì)胞中FOXP3、抑制性細(xì)胞因子如TGF-β和IL-10RA以及抑制性免疫檢查點因子CTLA4的表達(dá)更高。關(guān)于每個 T 細(xì)胞亞群中 SLIT 后的變化，MSC 和 IL-2 表達(dá)在 Trans Th2 中SLIT后上調(diào)，而TGF-β 表達(dá)在 Trans Th2和Treg細(xì)胞中SLIT后都上調(diào)（圖5C）。
圖5 比較功能性Th2細(xì)胞，功能抑制Th2細(xì)胞，Treg細(xì)胞間的基因表達(dá)
5、生物標(biāo)志物的潛力
鑒于MSC和IL-2表達(dá)的這些變化，以及它們在Trans Th2細(xì)胞中的強(qiáng)表達(dá)，作者從抑制Th2細(xì)胞功能的角度，在之前的柳杉抗原的SLIT臨床試驗樣本中，研究這些分子是否可以作為SLIT的生物標(biāo)志物。為了評估它們作為生物標(biāo)志物的實用性，通過PCR檢測了抗原刺激后整個PBMCs中MSC和IL-2的表達(dá)。與安慰劑組在SLIT后MSC沒有特別增加的樣本相比，活性藥物組在治療開始后1年MSC顯著增加（圖6B），IL-2表達(dá)在治療1年后也呈上升趨勢（圖6C）。此外，還分析了36例門診患者，以確定MSC是否可以作為SLIT療效的生物標(biāo)志物。SLIT治療前和治療后1年培養(yǎng)的PBMCs中，反應(yīng)良好的患者在SLIT后MSC表達(dá)明顯增加（圖7A）。然而，IL-2表達(dá)未見明顯變化（圖7B）。這些結(jié)果證明了評估 MSC在PBMC中的功效作為評估對SLIT的治愈反應(yīng)的有用性。
圖6 2/3期臨床試驗標(biāo)本中MSC和IL-2的分析
圖7 從反應(yīng)好的和反應(yīng)差的患者標(biāo)本中分析MSC和IL-2的表達(dá)
總之，本文通過結(jié)合單細(xì)胞分析和保留庫分析描述了SLIT引起的癥狀減輕機(jī)制。 具體而言，促進(jìn) MSC 在 Tpath2 細(xì)胞中的表達(dá)可能通過抑制 Th2 細(xì)胞功能并允許它們分化成 Treg 細(xì)胞來促進(jìn) SLIT 誘導(dǎo)的癥狀減輕。目前正在設(shè)計各種過敏原特異性免疫療法。由于MSC表達(dá)可用作其功效的標(biāo)志，開發(fā)有效產(chǎn)生 MSC 的方法可以提高這種療法的有效性。
參考文獻(xiàn)：
Iinuma Tomohisa., Kiuchi Masahiro., Hirahara Kiyoshi., Kurita Junya., Kokubo Kota., Yagyu Hiroyuki., Yoneda Riyo., Arai Tomoyuki., Sonobe Yuri., Fukuyo Masaki., Kaneda Atsushi., Yonekura Syuji., Nakayama Toshinori., Okamoto Yoshitaka., Hanazawa Toyoyuki.(2022). Single-cell immunoprofiling after immunotherapy for allergic rhinitis reveals functional suppression of pathogenic Th2 cells and clonal conversion. J Allergy Clin Immunol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1016/j.jaci.2022.06.024