多組學(xué)分析揭示了RNA剪接改變及其在肺腺癌中的生物學(xué)和臨床意義

選擇性RNA剪接是最重要的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制之一，有助于真核生物蛋白質(zhì)多樣性的形成，其失調(diào)是腫瘤發(fā)病的一個關(guān)鍵機(jī)制。近日，有作者系統(tǒng)地研究了肺腺癌（LUAD）的RNA剪接改變，并揭示了它們的生物學(xué)和臨床意義，為開發(fā)LUAD的剪接轉(zhuǎn)換療法奠定了基礎(chǔ)。該研究發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：38.104。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. LUAD中異常交替剪接事件的識別與統(tǒng)計

為了系統(tǒng)地揭示LUAD中的異?？勺兗艚邮录ˋASEs），作者收集了兩個數(shù)據(jù)集。一種是他們的綜合隊列，包括285個腫瘤樣本和145對高質(zhì)量的癌旁樣本。另一個是TCGA-LUAD隊列，包括514例腫瘤和59例癌旁樣本。主成分分析顯示，作者的整合隊列的腫瘤和鄰接正常樣本明顯被分為兩組（圖1a），說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量一致?；谶@兩個隊列，確定了28774個選擇性剪接事件（ASEs），它們影響8,726個基因，包括用于治療肺癌的酪氨酸激酶抑制劑的靶點（如EGFR、RET和MET） （圖1b）。這一結(jié)果支持了選擇性剪接模式可能改變LUAD患者的藥物反應(yīng)的可能性。在該研究中，鑒定了7種不同類型的ASEs，包括保留內(nèi)含子（RI）、相互排斥的外顯子（ME）、外顯子跳躍（ES）、交替終止子（AT）、交替啟動子（AP）、交替受體位點（AA）和交替供體位點（AD）（圖1c）。

此外，作者確定了影響2081個基因的3688個AASEs，其中AP和ES事件占絕大多數(shù)（圖1d）。雖然一些基因同時受到多種類型（最多3種）AASEs的影響，但大多數(shù)基因只受一種類型AASEs的調(diào)節(jié)（圖1e）。在LUAD患者中，7種AASEs的比例相似，大多數(shù)患者包含超過2,000種AASEs（圖1f）。在這3688個AASEs中，有1670個AASEs在TCGA LUAD隊列中也顯著異常，且其中97%（1620/1670）在兩個隊列中具有相同的上調(diào)或下調(diào)方向，這表明作者發(fā)現(xiàn)的AASEs是穩(wěn)健的。

在受AASEs影響的2081個基因中，有1981個基因?qū)儆诘鞍踪|(zhì)編碼基因，表明AASEs對編碼基因有明顯的影響，可能對LUAD產(chǎn)生重大影響。此外，大多數(shù)AASEs至少在75%的LUAD樣本中被鑒定出來（圖1g），這意味著以AASEs為靶點的治療可能會使許多LUAD患者受益。與相鄰正常組織相比，LUAD中NUMB跳變外顯子（NUMB PRRL）的包含量顯著增加（圖1h）。western blotting實驗進(jìn)一步驗證了LUAD樣品中NUMB PRRL / NUMB PRRS比值顯著升高（圖1i）。此外，生存分析顯示，較高的NUMB PRRL / NUMB PRRS比值表明較差的總生存（OS）（圖1j）。這些結(jié)果提示，NUMB的異常選擇性剪接可能是LUAD惡性的原因之一。未來需要進(jìn)一步研究該AASE在LUAD中的分子機(jī)制和干預(yù)價值。

圖1 LUAD中異常可變剪接事件（AASEs）及其相關(guān)基因概述

2. RNA結(jié)合蛋白（RBPs）對LUAD中AASEs的調(diào)控模式

ASAS最常見的調(diào)節(jié)因子之一是RBP, RBP的干擾會導(dǎo)致廣泛的ASAS。作者檢測到了100個差異表達(dá)的RBP，其中68個RBP在LUAD中表達(dá)上調(diào)，32個RBP表達(dá)下調(diào)（補(bǔ)充表2），即RBP在癌癥中傾向于上調(diào)。此外， 88個差異表達(dá)的RBP與2505個AASES顯著相關(guān)，產(chǎn)生了46704對RBP-ASE。約一半（47%）（2228 /46704）對為負(fù)相關(guān)（RBP水平越高，對應(yīng)的替代外顯子的包含水平越低），另一半為正相關(guān)，表明RBPS對AASES的調(diào)控在整體上是平衡的?；赗BPS和AASES之間的顯著相關(guān)性建立了失調(diào)網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)表明，受差異表達(dá)RBP影響的AASES相關(guān)基因富集于腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵過程和通路，如“RAS蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“NF - Κ B信號通路”、“WNT信號通路”，以及侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程和通路，如“細(xì)胞-基質(zhì)黏附”和“肌動蛋白絲運動”（圖2A），提示這些差異表達(dá)的RBP通過引起LUAD的剪接改變在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用。每個RBP調(diào)節(jié)的AASES數(shù)量在很大程度上是不同的，ALDH18A1、PDIA4和NUSAP1是調(diào)節(jié)AASES數(shù)量最多的RBP（圖2B）。

為了測量AASE調(diào)節(jié)的RBP對LUAD中藥物的影響，檢測在LUAD細(xì)胞系中具有最高調(diào)節(jié)能力的前20個RBP的表達(dá)和藥物活性之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌中4個上調(diào)的RBP與藥物敏感性相關(guān)。其中，DARS2基因與CMK和PHA-665752藥物的IC50值呈正相關(guān)，CNOT11基因與小白菊內(nèi)酯和SELICICLIB藥物的IC50值呈正相關(guān)，提示這些藥物的作用可能被DARS2和CNOT11在LUAD中的高表達(dá)所抑制。此外，DKC1基因與GSK319347A （TBK1和IKKΕ的雙重抑制劑）的IC50值呈負(fù)相關(guān)，PDIA4基因與PYRIMETHAMINE（具有抗癌和免疫刺激作用的STAT3抑制劑）的IC50值呈負(fù)相關(guān)24，這提示DKC1和PDIA4在LUAD中的高表達(dá)可能分別增加GSK319347A和PYRIMETHAMINE的敏感性（圖2C, D）。

圖2 RNA結(jié)合蛋白（RBPs）對AASEs的調(diào)控

為了直接調(diào)控ASEs，大多數(shù)RBP必須與剪接位點附近相應(yīng)的基序結(jié)合?；贒eepBind的結(jié)果和顯著的RBP-ASE對，作者構(gòu)建了一個更穩(wěn)健但更小的失調(diào)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)反映了三個RBP介導(dǎo)了LUAD中的438個AASEs，其中AT、AP和ES占最多（圖3a）。在這些RBPs中，IGF2BP3介導(dǎo)的AASEs數(shù)量最多，受這些AASEs影響的基因在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中富集，如"細(xì)胞外基質(zhì)組織"、"細(xì)胞連接組織"和"細(xì)胞-基質(zhì)黏附"。由KHDRBS2調(diào)節(jié)的AASEs也在類似的生物學(xué)過程中富集（圖3b）。作者對差異盒外顯子兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄序列進(jìn)行基序掃描分析，并與非差異盒外顯子進(jìn)行比較。這些分析表明，IGF2BP3的保守結(jié)合基序在上游和下游剪接位點附近150 bp的上調(diào)的盒外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域中顯著地過度表達(dá)。IGF2BP3保守的結(jié)合基序也在下調(diào)的盒外顯子上游150-300 bp的內(nèi)含子區(qū)域中顯著過度表達(dá)（圖3c）。對于KHDRBS2，結(jié)合基序顯著富集于下調(diào)的盒外顯子上游約150-300 bp的內(nèi)含子區(qū)域，以及上調(diào)的盒外顯子下游約150-300 bp的內(nèi)含子區(qū)域（圖3d）。作者還觀察到Y(jié)BX2結(jié)合基序在上調(diào)外顯子內(nèi)以及上調(diào)外顯子下游約150 bp處顯著富集。YBX2的保守結(jié)合基序也顯著地在下調(diào)的盒外顯子下游約0-150 bp的內(nèi)含子區(qū)域中過度表達(dá)（圖3e）。因此，基序搜索分析進(jìn)一步證實了這三個RBP對AASEs的調(diào)控作用。綜上所述，這些結(jié)果全面揭示了RBPs在肺腺癌中對AASEs的調(diào)控作用，提示RBPs干擾了肺腺癌中具有關(guān)鍵功能意義的選擇性剪接譜，并為開發(fā)新的治療策略提供了重要信息。

圖3 RBP對AASEs的更強(qiáng)調(diào)控作用

3. LUAD中AASEs的DNA突變和甲基化調(diào)控模式

據(jù)報道，DNA突變也可能通過改變調(diào)節(jié)RNA序列、RBP結(jié)構(gòu)或其他調(diào)節(jié)分子來影響ASEs。對ASEs具有調(diào)控作用的單核苷酸變異（SNV）被稱為剪接數(shù)量性狀位點（sQTL）。該文應(yīng)用MatrixEQTL算法在LUAD中發(fā)現(xiàn)sQTL。一般來說，如果調(diào)控SNV在其相應(yīng)的剪接位點附近100 Kbp范圍內(nèi)，這個SNV被定義為cis-sQTL;否則，它是反式sQTL。因此，只發(fā)現(xiàn)了1個順式sQTL，其中TP53剪接位點的突變會增加外顯子10的包含水平（圖4a）。還發(fā)現(xiàn)36個反式sQTL在肺腺癌中調(diào)節(jié)廣泛的ASEs。在LUAD中，trans-sQTLs不規(guī)則地定位于染色體上。trans-sQTL調(diào)控chr1上的200多個酶，而調(diào)控chr13、chr18和chr21上的不到50個酶（圖4b）。這些結(jié)果全面揭示了sQTLs的模式，并幫助更好地理解肺腺癌復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)。

除了DNA突變之外，表觀基因組學(xué)研究還揭示，DNA甲基化可能通過甲基化-CpG結(jié)合蛋白2和異染色質(zhì)蛋白在剪接調(diào)控中發(fā)揮作用。為了研究AASEs是否部分由DNA甲基化水平紊亂引起，首先在可變剪接外顯子邊界處確定了1980個CpG位點（圖4c）。將CpG位點在肺腺癌和癌旁正常組織之間進(jìn)行比較后，確定了56個具有差異甲基化水平的CpG位點（圖4d）。然后研究了這些差異甲基化的CpG位點對其對應(yīng)的AASEs的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)21個CpG位點與AASEs顯著相關(guān)。除了一個CpG位點外，所有這些CpG位點都與其對應(yīng)的AASEs呈負(fù)相關(guān)，并且這些AASEs都屬于AP （alternative promoter，也稱為alternative first exons）（圖4e）。也就是說，替代第一外顯子邊界附近的CpG位點甲基化水平越高，替代啟動子的使用率越低。為了研究這一規(guī)律是否在癌癥中普遍存在，接著分析了30種其他類型癌癥中CpG位點及其對應(yīng)的ASEs之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受CpG位點調(diào)控的ASEs絕大多數(shù)是AP事件（圖4f），大部分AP事件的包含水平與相應(yīng)CpG位點的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)（圖4g）。此外，對AP事件具有調(diào)控作用的CpG位點大多位于啟動子區(qū)域，少部分位于基因體區(qū)域（圖4h）。所有這些結(jié)果表明，DNA甲基化對ASEs在腫瘤中的主要作用是抑制替代啟動子的使用。

圖4 LUAD中DNA突變和甲基化對AASE的調(diào)控模式

4. AASEs在LUAD中的功能意義

在本研究中，受AASEs影響的2081個基因中，大多數(shù)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平都有不同的亞型。這些結(jié)果表明，這些基因的異常剪接可能導(dǎo)致相當(dāng)大的功能變化（圖5a）。為了進(jìn)一步揭示AASEs對肺腺癌的生物學(xué)作用，對受AASEs影響的基因進(jìn)行了基因本體論（GO）富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在7種類型的ASEs中，只有受異常AP和ES事件影響的基因在癌癥相關(guān)的GO術(shù)語中顯著富集。異常的AP事件主要影響促進(jìn)腫瘤增殖的通路：“小GTP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”，如“Ras信號通路”和“Rho信號通路”。異常ES事件主要影響與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)過程，如“纖毛組裝”、“細(xì)胞連接組織”和“細(xì)胞-基質(zhì)黏附”（圖5b）。為了更深入地研究AASEs的功能意義，通過單樣本基因集富集分析（ssGSEA）方法測量了14個腫瘤標(biāo)記物的活化程度，并研究了AASEs與這些標(biāo)記物活化程度之間的關(guān)系。AASEs影響最多的標(biāo)記為“TGF β信號通路”、“細(xì)胞信號傳導(dǎo)”、“細(xì)胞周期過程”和“Ras信號通路”。然而，“EMT過程”和“前體代謝物和能量的生成”幾乎沒有受到影響（圖5c）。進(jìn)一步研究與癌癥特征相關(guān)的AASEs所富集的生物學(xué)過程，并利用蜂巢圖展示了AASEs（左軸）如何與癌癥特征（中軸）相關(guān)，以及受這些AASEs影響的基因（右軸）的功能富集。作者發(fā)現(xiàn)與許多標(biāo)志相關(guān)的AASEs也在“細(xì)胞-基質(zhì)連接組裝”和“細(xì)胞-基質(zhì)黏附”中顯著富集（圖5d）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，肺腺癌中的AASEs在與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)過程中具有實質(zhì)性的功能意義。

圖5 AASEs的功能含義

5. 基于AASEs的LUAD亞型分類具有明顯的生物學(xué)特征

基于RNA剪接模式的分子分型已被證明可對其他腫瘤類型中具有不同預(yù)后或治療效果的患者進(jìn)行分層，因此可用于改善LUAD的患者分層?；?688個AASEs，通過共識聚類分析將514個TCGA LUAD樣本分為3個亞型:G1 （n = 176, 34.2%）， G2 （n = 130, 25.3%）和G3 （n = 208, 40.5%）。與G1和G2相比，G3的AASEs總數(shù)（AASEs頻率）最高（圖6a）。7種AASEs在3種亞型中的比例相似（圖6b），此外，AASEs頻率高表明肺腺癌中免疫細(xì)胞浸潤程度高，預(yù)后好（圖6c, d）。LUAD的三個AASE亞型具有特定的AASE特征和模式。例如，TRIM7、MLK4、ADNP和TRAP1等腫瘤相關(guān)基因的AP事件在G1中包含量較高。腫瘤相關(guān)基因如DDX17、PLCB2、SEMA6C的AASEs在G2中包含量較高。而腫瘤相關(guān)基因如ARMC3、TPM4和TNFRSF12A的AASEs在G3中包含量較高（圖6e）。

進(jìn)一步研究了這三種亞型的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)G1是一個快速增殖的亞型，富集的通路有“細(xì)胞周期”、“DNA修復(fù)”、“DNA復(fù)制”等（圖6f）。G1也是一個高代謝亞型，通路富集在“氧化磷酸化”、“葡萄糖代謝”、“蛋白質(zhì)代謝”、“核苷酸代謝”等（圖6f），提示G1可能從傳統(tǒng)的靶向高增殖細(xì)胞的化療中獲益更多。G3具有特定的代謝模式，其特征是偏好脂肪酸代謝（圖6f）。此外，G3是一個具有高細(xì)胞黏附分子、高PD1信號（圖6f）和低干性指數(shù)、低端粒酶活性（圖6g）的亞型。此外，在CpG島啟動子區(qū)域收集了719個用于鑒定LUAD甲基化亞型的最可變的DNA甲基化特異性探針，根據(jù)這些探針，G2為高甲基化，而G3為低甲基化（圖6h, i）。

圖6三種LUAD亞型的AASEs及其生物學(xué)特性

6. AASE亞型LUAD具有明顯的免疫特性

由于AASEs頻率與免疫細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步深入表征了AASEs亞型的免疫特征。首先，評估并比較了三種亞型中22種免疫細(xì)胞的浸潤水平。結(jié)果顯示，11種細(xì)胞類型顯示出顯著差異，包括7種固有免疫細(xì)胞和4種適應(yīng)性免疫細(xì)胞（圖7a）。大多數(shù)細(xì)胞類型在G3亞型中表現(xiàn)出最高的浸潤水平，例如CD4 +記憶靜息T細(xì)胞和髓樣樹突狀細(xì)胞（圖7b）。所有免疫細(xì)胞的浸潤水平在G3中也是最高的（圖7c）。

通過ssGSEA分析量化了每個腫瘤樣本中17條免疫通路的激活程度，發(fā)現(xiàn)有16條通路在3種亞型中表現(xiàn)出顯著差異（圖7d）。許多對抑制腫瘤生長至關(guān)重要的免疫通路在G3中持續(xù)上調(diào)，如“抗原處理和呈遞”、“NK細(xì)胞細(xì)胞毒性”和“TCR信號通路”（圖7e）。與免疫細(xì)胞的浸潤水平一致，腫瘤微環(huán)境中所有免疫通路的激活水平在G3中最高（圖7f）。

為了使免疫微環(huán)境的評估更加全面，進(jìn)一步檢測了每個腫瘤中的78種免疫調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)19種免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)水平在3種亞型之間存在顯著差異（圖7g）。大多數(shù)差異表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)劑在G3亞型中最高，包括重要的共刺激分子（CD28和CD80）和抗原呈遞基因（HLA-DPA1和HLA-DRA）（圖7h）。G3中78種免疫調(diào)節(jié)劑的總表達(dá)量也是最高的（圖7i）。HE染色顯示，G3中浸潤的免疫細(xì)胞比例最高，提示G3確實是“熱”腫瘤（圖7j, k）。IHC染色和組織評分（H-score）分析發(fā)現(xiàn)，CD8和PD-L1是免疫治療療效的關(guān)鍵免疫標(biāo)志物和預(yù)測因子，在G3中最高（圖7j, k）。

圖7 LUAD AASE亞型的免疫特性

7. LUAD AASE亞型的臨床意義

免疫原性微環(huán)境意味著良好的預(yù)后和對免疫檢查點阻斷劑的良好應(yīng)答率。由于G3亞型的免疫浸潤始終較高，其G3級預(yù)后最好，可作為獨立預(yù)后因素（圖8a）。此外，這三種LUAD亞型對靶向不同通路的不同藥物敏感，但它們都對HSP抑制劑敏感，如AT-13387和諾米林（圖8b）。通過細(xì)胞增殖實驗，證實兩種藥物均能顯著抑制肺腺癌細(xì)胞株A549、NCI-H2347、NCI-H441的增殖（圖8c），且這兩種藥物對細(xì)胞生長的影響通過集落形成實驗進(jìn)一步證實（圖8d）。這些結(jié)果一致表明，AASE亞型不僅可以反映腫瘤實質(zhì)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，而且可以反映腫瘤免疫微環(huán)境。

圖8 LUAD AASE亞型的臨床意義

結(jié)論：

總之，改研究系統(tǒng)地研究了AASEs在LUAD中的應(yīng)用，并從多個角度揭示了AASEs及其調(diào)控因子的生物學(xué)相關(guān)性。闡明了剪接調(diào)控異常對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，為設(shè)計LUAD的剪接切換治療方法奠定了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步認(rèn)識LUAD的分子特征，促進(jìn)LUAD的基礎(chǔ)研究和精準(zhǔn)醫(yī)療。