姜黃烯醇通過(guò)lncRNA H19/miR-19b-3p/FTH1軸觸發(fā)肺癌細(xì)胞鐵死亡

肺癌是最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。盡管現(xiàn)有藥物在晚期肺癌的治療中取得了許多進(jìn)展，但由于其相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)、劑量限制性毒性、耐藥和較差的選擇性，其治療效果有限。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療策略或新的有效藥物來(lái)治療肺癌。姜黃烯醇是溫瘀金的有效成分，已被報(bào)道在幾種腫瘤中發(fā)揮其抗腫瘤潛力。然而，姜黃烯醇在肺癌中的作用和分子機(jī)制尚不清楚。該研究發(fā)表于《Bioactive Materials》，IF:12.91。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡，抑制肺癌細(xì)胞增殖

為了評(píng)估姜黃烯醇對(duì)肺癌的抗癌潛力，研究者在人肺成纖維細(xì)胞(CCD19)，人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)和肺癌細(xì)胞(H1299和H460)中使用不同濃度的姜黃烯醇處理24小時(shí)。研究者發(fā)現(xiàn)，姜黃烯醇在肺癌細(xì)胞中以濃度依賴性方式抑制細(xì)胞存活，但在正常肺細(xì)胞中毒性相對(duì)較小(圖1A和B)。表明莪術(shù)醇對(duì)肺癌細(xì)胞有選擇性的細(xì)胞毒性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃烯醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響；如圖1C和D所示，與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇以劑量依賴性方式顯著抑制肺癌細(xì)胞的集落形成。采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)姜黃烯醇對(duì)H1299和H460細(xì)胞死亡的影響。與對(duì)照組相比，姜黃烯醇處理后的肺癌細(xì)胞中死亡細(xì)胞的百分比較高。然而，總體的細(xì)胞凋亡較低(圖1E和F)，這可能是由于凋亡不是姜黃烯醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的主要模式。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明姜黃烯醇降低肺癌細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖1 姜黃烯醇處理H1299和H460細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞活力

2. 鐵死亡是姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡的主要方式

采用程序性壞死抑制劑Nec-1、自噬抑制劑氯喹、泛caspase抑制劑Z-VAD以及鐵死亡抑制劑去鐵胺(DFO)、Ferrostatin (Fer-1)和liprostatin -1 (Lip-1)評(píng)估姜黃烯醇誘導(dǎo)的主要細(xì)胞死亡程序。結(jié)果表明，Nec-1, Z-VAD和CQ不能明顯抑制姜黃烯醇在H1299和H460細(xì)胞中引起的細(xì)胞死亡(圖2A-C)。然而，鐵死亡抑制劑DFO、Fer-1和Lip-1顯著挽救了姜黃烯醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖2D-F)。這些結(jié)果證明，鐵死亡可能是姜黃烯醇誘導(dǎo)的主要細(xì)胞死亡程序。

為進(jìn)一步確定姜黃烯醇是否通過(guò)鐵死亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，western blot檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白。研究者的數(shù)據(jù)顯示姜黃烯醇處理顯著增加了肺癌細(xì)胞中血紅素加氧酶1 (HO-1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)水平，但降低了谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4 (GPX4)、溶質(zhì)載體家族40成員1 (SLC40A1)、溶質(zhì)載體家族7成員11 (SLC7A11)、鐵蛋白重鏈1 (FTH1)、核因子e2相關(guān)因子2 (NRF2)和谷氨酰胺酶的表達(dá)水平(圖3A)。此外，鐵螯合劑DFO可以挽救姜黃烯醇誘導(dǎo)的鐵死亡蛋白的表達(dá)(圖3B)。

在隨后的實(shí)驗(yàn)中，研究者進(jìn)行了RNA測(cè)序，以研究姜黃烯醇處理后的差異轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)。采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)篩選并鑒定差異表達(dá)基因。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論(GO)分類(lèi)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路分析。因此，在H1299細(xì)胞中確定了1,665個(gè)上調(diào)基因和1,232個(gè)下調(diào)基因。在H460細(xì)胞中確定了1,484個(gè)上調(diào)基因和759個(gè)下調(diào)基因。GO富集分析顯示，氧化還原過(guò)程和氧化還原酶活性得到富集。同時(shí)，KEGG分析發(fā)現(xiàn)鐵死亡通路被富集(圖3C和D)。這些結(jié)果表明姜黃烯醇處理后肺癌細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡。

眾所周知，活性氧(ROS)蓄積、還原型谷胱甘肽(GSH)耗竭、脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化還原活性鐵過(guò)載是鐵死亡過(guò)程中的關(guān)鍵事件。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛(MDA)和細(xì)胞內(nèi)螯合鐵水平。正如預(yù)期的那樣，姜黃烯醇處理后觀察到ROS水平增加(圖4A)和GSH水平降低(圖4B和C)。此外，鐵螯合劑DFO可以消除姜黃烯醇引起的GSH耗竭(圖4D和E)。同時(shí)，姜黃烯醇處理上調(diào)了肺癌細(xì)胞中的MDA水平(圖4F)。此外，鐵敏感熒光團(tuán)Phen Green SK被用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)螯合鐵，鐵結(jié)合后被淬滅。正如預(yù)期的那樣，與對(duì)照組相比，姜黃烯醇處理降低了Phen Green sk陽(yáng)性細(xì)胞的比例，而鐵螯合劑DFO可以消除這一現(xiàn)象(圖4G)，表明鐵死亡被觸發(fā)。因此，這些結(jié)果表明鐵死亡是姜黃烯醇觸發(fā)肺癌細(xì)胞死亡的主要機(jī)制。

圖2 姜黃烯醇單獨(dú)或聯(lián)合不同細(xì)胞死亡抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞活力的影響

圖3 姜黃烯醇誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡

圖4 鐵死亡促進(jìn)了姜黃烯醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞死亡

3. 姜黃烯醇在肺癌異種移植模型中引發(fā)鐵死亡

建立肺癌皮下移植瘤模型，評(píng)價(jià)莪術(shù)醇的體內(nèi)抗腫瘤作用。皮下移植瘤體積達(dá)80 ~ 100 mm3后，將裸鼠隨機(jī)分為溶劑組、莪術(shù)醇組(200 mg/kg/d)、去鐵胺組(100 mg/kg/d)和藥物聯(lián)合組。研究者的數(shù)據(jù)顯示，姜黃烯醇顯著抑制了異種移植瘤的生長(zhǎng)，并且姜黃烯醇的抗腫瘤作用可以被鐵死亡抑制劑DFO消除(圖5A和B)。然而，對(duì)照組和姜黃烯醇處理組的體重沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5C)，表明姜黃烯醇沒(méi)有明顯的毒性。在進(jìn)一步的研究中，研究者通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)研究了姜黃烯醇對(duì)鐵死亡的影響。姜黃烯醇處理后，GPX4, FTH1和SLC7A11的水平降低，HO-1和轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)增加，表明姜黃烯醇觸發(fā)鐵死亡。此外，與鐵螯合劑DFO共處理后，姜黃烯醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡幾乎被消除(圖5D)。綜上所述，研究者的結(jié)果表明姜黃烯醇在體內(nèi)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

圖5 姜黃烯醇在肺癌異種移植模型中觸發(fā)鐵死亡

4. lncRNA H19表達(dá)與姜黃烯醇誘導(dǎo)鐵死亡的相關(guān)性

 為了確定lncRNA在姜黃烯醇抗癌作用中的作用，研究者進(jìn)行了RNA測(cè)序。研究者發(fā)現(xiàn)，與未處理的細(xì)胞相比，姜黃烯醇處理的肺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19顯著下調(diào)(圖6A)。類(lèi)似的結(jié)果通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)(圖6B)。為了研究lncRNA H19在姜黃烯醇誘導(dǎo)的鐵死亡中的生物學(xué)功能，研究者在H1299和H460細(xì)胞中分別通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和shRNA來(lái)過(guò)表達(dá)或敲低lncRNA H19。lncRNA H19過(guò)表達(dá)顯著增加了鐵死亡負(fù)調(diào)控因子(NRF2、GPX4、FTH1和SLC7A11)的表達(dá)水平(圖6C-E)。相比之下，lncRNA H19敲低顯著降低了鐵死亡負(fù)調(diào)控因子(NRF2、GPX4、FTH1和SLC7A11)的表達(dá)水平(圖6F-H)。因此，研究者的結(jié)果表明lncRNA H19參與了姜黃烯醇誘導(dǎo)的鐵死亡。

為了研究lncRNA H19對(duì)姜黃烯醇誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，研究者在H1299和H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或shRNA?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和CCK-8結(jié)果顯示，lncRNA H19過(guò)表達(dá)顯著消除了姜黃烯醇對(duì)H1299和H460細(xì)胞的抑制作用(圖7A-F)。相反，lncRNA H19敲低顯著抑制了H1299和H460細(xì)胞的克隆形成，增強(qiáng)了姜黃烯醇對(duì)這些細(xì)胞的抗癌作用(圖7G-L)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明lncRNA H19是姜黃烯醇誘導(dǎo)鐵死亡的關(guān)鍵決定因素。

圖6 lncRNA H19表達(dá)與姜黃烯醇誘導(dǎo)鐵死亡的相關(guān)性

圖7 lncRNA H19對(duì)姜黃烯醇誘導(dǎo)鐵死亡的影響

5. 姜黃素通過(guò)lncRNA H19/miR-19b-3p/FTH1軸誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA可以作為ceRNA或與RNA結(jié)合蛋白相互作用來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。因此，研究者基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Starbase)中l(wèi)ncRNA- miRNA和miRNA-mRNA的相互作用構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19可能靶向miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-200b和miR-675。在4個(gè)候選miRNA中，與對(duì)照組相比，經(jīng)莪術(shù)醇處理后，H1299和H460細(xì)胞中miRNA-19b-3p的表達(dá)水平顯著升高(圖8A-C)。有趣的是，在泛癌分析中，miR-19b-3p與FTH1在肺鱗狀細(xì)胞癌(圖8D)和腺癌中呈負(fù)相關(guān)。由于研究者已經(jīng)證明lncRNA H19可以調(diào)控H1299和H460細(xì)胞中FTH1的表達(dá)(圖6C-H)，研究者有理由推測(cè)lncRNA H19通過(guò)靶向miR-19b-3p調(diào)控FTH1水平。結(jié)果顯示，lncRNA H19過(guò)表達(dá)抑制H1299和H460細(xì)胞中miR-19b-3p水平(圖8E)。相比之下，lncRNA H19敲低增強(qiáng)了H1299和H460細(xì)胞中miR-19b-3p的表達(dá)(圖8F)。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p mimics降低了FTH1的表達(dá)，但增加了姜黃烯醇在H1299和H460細(xì)胞中的抗癌活性(圖8G-L)。相反，miR-19b-3p抑制劑增加了FTH1的表達(dá)，但減弱了姜黃烯醇在H1299和H460細(xì)胞中的抗癌活性(圖8M-R)。這些數(shù)據(jù)表明姜黃烯醇通過(guò)lncRNA H19/miR-19b-3p/FTH1軸觸發(fā)肺癌細(xì)胞的鐵死亡。

圖8 姜黃烯醇通過(guò)lncRNA H19/miR-19b-3p/FTH1軸誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡

結(jié)論：

該研究表明，天然產(chǎn)物姜黃烯醇通過(guò)觸發(fā)鐵死亡發(fā)揮其抗腫瘤作用，并且lncRNA H19/miR-19b-3p/FTH1軸在姜黃烯醇誘導(dǎo)的鐵死亡細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。本研究有望為肺癌患者提供潛在的治療藥物。

參考文獻(xiàn)：

Ruonan Zhang, Ting Pan, Yu Xiang, et al. Curcumenol triggered ferroptosis in lung cancer cells via lncRNA H19/miR-19b-3p/FTH1 axis. Bioactive Materials. Volume 13, 2022, Pages 23-36, ISSN 2452-199X, https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.11.013.