17分生信——circRNA單細胞圖譜首發(fā)

以往的研究表明，circRNAs在不同的組織和生物中具有高度特異性的表達，但circRNAs的細胞水平結構尚未完全確定。本文表征了circRNAs在人類和小鼠組織單細胞水平的表達圖譜，將我們對circRNAs表達的了解擴展到單細胞水平，并構建了circRNAs的單細胞數(shù)據(jù)集的在線網(wǎng)站，為以這種前所未有的分辨率探索circRNAs提供了有用的資源。本文于2022年6月發(fā)表在《Nature Communications》IF：17.694期刊上。

技術路線

主要研究結果：

1、大規(guī)模單細胞研究顯示circRNA具有高度細胞特異性

為了闡明circRNA的細胞構架，作者收集了171項涉及58種不同人類和小鼠組織或細胞類型的公開全長scRNA-seq數(shù)據(jù)集（圖1a）?？紤]到大多數(shù)3’RNA測序方法無法檢測到缺乏poly(A)尾的circRNA，所以作者只收集全長測序技術的研究，然后使用嵌入多個最先進工具的綜合管道計算基因和 circRNA 的單細胞水平表達值（圖1b）?？傊?，40,604個人類和131,533個小鼠單細胞通過質(zhì)量控制，并檢測這些細胞中的circRNA進行下游分析。為了評估circRNA檢測的可靠性，將所有的單細胞數(shù)據(jù)中的circRNA比對至circAtlas v2.0或其它數(shù)據(jù)庫中。如圖1c所示，在scRNA-seq隊列中共檢測到354,390個circRNA，其中76,824（21.67%）個circRNA可以在所有三個circRNA組中同時檢測到?？傊?2.43%的circRNA存在于這些批量RNA-seq數(shù)據(jù)庫中，而其余67.57%的circRNA只在單細胞數(shù)據(jù)中檢測到。值得注意的是，在circAtlas中唯一檢測到的circRNAs比在circAtlas和單細胞數(shù)據(jù)集中共享的表達水平更低且長度更短（圖1d，e）。這表明scRNA-seq可以有效捕獲大多數(shù)高豐度circRNA。此外，通過MCS評分，這些共享的circRNA顯示出很高的組織特異性，48.9%的共享的circRNA在兩個以上物種中保守（MCS評分≥2），表明鑒定的circRNA具有很高的可靠性（圖1f）。

對于所有在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中檢測到的circRNAs，其表達細胞數(shù)量與其平均表達水平之間正相關，一些高表circRNA如mmu-Cdr1_0001、mmu-Tulp4_0006和hsa-RIMS1_0021也在之前的研究中被報道（圖1g）。再次證實了數(shù)據(jù)分析的可靠性。同時，在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中唯一檢測到的 circRNA 通常在較少數(shù)量的細胞中表達（圖 1h），但與其他數(shù)據(jù)庫驗證的 circRNA 相比具有相似的表達水平（圖1i），提示這些circRNA具有高度的細胞特異性。特別是在人類和小鼠樣本中，約 90% 的 scRNA-seq 特異性 circRNA 在不到 10 個細胞中表達，這使得使用bulk RNA-seq 技術幾乎無法檢測到（圖1j）。綜上所述，這些結果表明全長 scRNA-seq在揭示具有高細胞特異性的 circRNA 方面具有高靈敏度和可靠性，而由于在傳統(tǒng)bulk RNA-seq 樣本中表達細胞的比例相對較低，其中大部分可能被錯誤地忽略。此外，這些 scRNA-seq 特異性 circRNA 還在具有超過 10 個反向剪接讀數(shù)的細胞中廣泛表達（圖1k）。

圖1從單細胞測序數(shù)據(jù)集這發(fā)現(xiàn)circRNAs

2、腦circRNA在抑制性和興奮性神經(jīng)元中顯示細胞特異性表達模式

為了研究 circRNA 的細胞景觀，首先收集并分析了 18 項對小鼠大腦樣本的研究，這也是收集的數(shù)據(jù)集中最大的隊列，并分析和整合人類的腦細胞。共將41,911個細胞分為14個簇，檢測到64,311個circRNA（圖2a）。如圖2b所示，大多數(shù)細胞聚集成GABA能神經(jīng)元（GABA）、谷氨酸能神經(jīng)元（GLUT）和小膠質(zhì)細胞（MG）。 盡管這些簇中的細胞數(shù)量相似，但 GABA 能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元中circRNA尤其地豐富。作者對12個細胞特異性circRNA進行了PCR驗證，并采用廣泛使用的Tau方法檢測了circRNA的細胞特異性，并將基因分為circRNA宿主基因和其他基因進行進一步的比較，如圖2c所示，circRNA的特異性明顯高于兩組基因。同時，circRNA宿主基因的特異性也顯著低于其他非宿主基因，因為circRNA往往來源于具有較高表達水平的基因，這導致細胞特異性相對較低。例如，在神經(jīng)元細胞中特異性檢測到來自小鼠 Taf1 基因的 12 個 circRNA 中的 10 個，并且在 GABA 能和谷氨酸能神經(jīng)元中也觀察到了不同的表達模式（圖 2d）。

為了進一步驗證circRNA在人腦中的表達譜，收集4個人腦scRNA-seq數(shù)據(jù)集，如圖 2e 所示，具有較高表達水平的 circRNA 在兩個物種中更可能是保守的，而物種特異性 circRNA往往具有較低的表達水平。與之前的結果一致，這些保守的circRNA中的大多數(shù)在 GABA 能和谷氨酸能神經(jīng)元中高度富集，并且一部分circRNA也表現(xiàn)出在所有類型的細胞中普遍表達（圖 2f）。circRNA的表達水平與RNA結合蛋白（RBP）的活性密切相關，作者計算了所有circRNA與所有細胞中circRNA宿主基因或RBP之間的Spearman相關系數(shù)并進行比較，結果發(fā)現(xiàn)circRNA與RBP之間的相關性顯著高于宿主基因（圖2g），尤其是PTBP1和PTBP2和circRNA高度相關。如預期的，在大多數(shù)細胞類型中，circRNA的表達水平，如circCdr1和circular-to-linear比率與PTBP1的下調(diào)及其補償因子PTBP2的上調(diào)高度相關（圖2h）?？傊?，這些結果證明了circRNA的高度細胞特異性表達景觀，并進一步揭示了circRNA生物發(fā)生與RBP活性之間的復雜關聯(lián)，特別是在這些抑制性和興奮性神經(jīng)元中。

圖2 抑制性和興奮性神經(jīng)元中具有豐富的circRNA

3、早期胚胎發(fā)育過程中母體和合子circRNA的動態(tài)表達

單細胞RNA測序使胚胎發(fā)育階段的基因異質(zhì)性研究成為可能，但這一過程中circRNA表達模式的變化仍需進一步探索。作者分析了11項人類和小鼠胚胎研究，其中包含來自16個從卵母細胞到早期芽的不同階段的樣本（圖 3a）。在人和小鼠胚胎中分別檢測到41,041和24,818個circRNA。為了揭示胚胎發(fā)育過程中circRNA之間的動態(tài)變化，計算了不同階段circRNA表達水平之間的Pearson相關性。如圖3b所示，在受精后的前3-4天觀察到細胞之間的高度相關性，這與circRNA在早期胚胎發(fā)育過程中的母體效應一致。此外，從囊胚到植入胚胎的細胞表現(xiàn)出不同的 circRNA 表達模式，表明合子 circRNA 在囊胚期后表達。此外，在人類和小鼠樣本上均觀察到在發(fā)育階段檢測到的circRNA的多樣性和連接率都有所增加，這也驗證了這些合子circRNAs在胚胎發(fā)育過程中的積累（圖3c）。考慮到在人類數(shù)據(jù)集中只收集到相對較少的細胞，下游分析只包括小鼠胚胎。為了消除隨機性效應，可以在兩個以上階段檢測到circRNA的表達模式繪制在圖3d中。如預期的，觀察到母體 circRNAs 逐漸降解，大多數(shù)其他 circRNAs 表現(xiàn)出階段特異性表達譜。為進一步研究母體向合子轉(zhuǎn)變過程中circRNA的動態(tài)表達變化，將樣本分為四個時間點，包括全能卵裂球（TB）、第一譜系（TE/ICM）、第二譜系（EPI/PE）和植入胚胎，反映發(fā)育過程中全能性和譜系分離的變化。隨后，將基因和circRNA聚類為5組。如圖3e所示，簇1和簇2中的circRNA和基因在TB早期高表達，然后隨著胚胎發(fā)育不斷下降。相反，第3到第5簇 circRNA代表受精后特異性表達的合子circRNA。

為確定合子circRNA的激活是否是宿主基因表達的副產(chǎn)物，檢查了circRNA與其宿主基因之間的對應關系。大部分合子circRNA（簇3中67.50%、簇4中69.2%和簇5中83.9%）是由母體表達的基因產(chǎn)生的，這表明這些合子circRNA在胚胎發(fā)育過程中具有獨特的生物發(fā)生機制（圖3h）。為進一步研究合子基因和circRNA激活過程之間的差異，計算每個簇中基因和circRNA的reads組成。僅包括在一個以上階段中同時表達的circRNA。與發(fā)育階段合子基因讀數(shù)的溫和增加相反，在圖3g中觀察到8個細胞階段后合子 circRNA的急劇爆發(fā)，為母體circRNA降解和合子circRNA激活提供了令人信服的證據(jù)。例如，作者展示了兩個合子和三個母體 circRNA 的不同表達模式。如圖3h所示，源自Erdr1的mmu-Erdr1_0001和mmu-Erdr1_0002是一種調(diào)節(jié)細胞存活和細胞凋亡的分泌因子，在植入的胚胎中高度表達。因此，這些circRNA的高度特異性表達表明，與線性基因相比，circRNA 經(jīng)歷了更顯著的母體到合子的轉(zhuǎn)變過程。最后，對母本和合子circRNA的親本基因進行基因本體富集分析。如圖3i所示，基于微管的運動和纖毛組裝在母體circRNA中富集，而剪接相關過程在合子circRNA中富集，這與發(fā)育中胚胎的極性建立和胚胎基因組激活一致。總的來說，這些結果證明了circRNA 的高度細胞特異性表達譜和合子circRNA在胚胎發(fā)育中的大量激活，這也表明了這些母體和合子circRNA 在此過程中的重要作用。

圖3 母體向合子轉(zhuǎn)變過程中合子circRNA 激活的解析

4、在人類乳腺癌轉(zhuǎn)移中的腫瘤間和腫瘤內(nèi)circRNA異質(zhì)性

為分析乳腺癌腫瘤發(fā)生過程中的單細胞水平的circRNA，對26個原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤 scRNA-seq 樣本進行分析，如圖4a所示。然后，進一步研究正常人群和癌人群circRNA表達水平的差異。如圖4b所示，超過49.88%的正常人群和67.28%的癌人群被鑒定為上皮細胞。與之前的研究一致，非整倍體重排的腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)瘤中circRNAs的表達均顯著降低（圖4c），在大多數(shù)已鑒定的細胞類型中也觀察到同樣的情況（圖4d）。來自預后較好的低級別（luminal A、luminal B和HER2陰性）腫瘤的正常細胞和癌細胞往往比高級別三陰性乳腺癌（TNBC）細胞表達更多的circRNA，這表明積累較少TNBC細胞中的circRNAs 具有更快的進展速度。

鑒于該隊列中上皮細胞的主要數(shù)量以及EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的重要作用，所以作者進一步研究了EMT期間的circRNA。首先，將所有上皮細胞聚集在一起，并進行軌跡推斷分析以揭示動態(tài)細胞的分化過程（圖4f）。為了更好地探索單個細胞的過渡狀態(tài)，計算了EMT分數(shù)。如圖4g所示，細胞軌跡結果通常相應地擬合EMT分數(shù)的增加。GO富集分析上皮細胞增殖過程在EMT評分較低的簇中富集，而細胞遷移和間充質(zhì)相關過程在EMT水平較高的簇中富集。此外，計算每個簇中癌細胞的比例，并相應地觀察到腫瘤細胞百分比與EMT評分之間的正相關（圖4h）。最后計算每個簇中circRNA的表達水平，隨著從上皮細胞（簇 1-2）到中間EMT狀態(tài)（簇 3-5）的轉(zhuǎn)變，circRNA 的平均表達水平相應增加（圖 4i），這與EMT期間circRNA的全局激活一致?？傊髡叻治隽薊MT期間circRNA表達的詳細概況，揭示了乳腺癌患者原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性樣本之間circRNA 的復雜腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

圖4 乳腺癌患者正常細胞和腫瘤細胞之間circRNA的異質(zhì)性

5、細胞特異性circRNA為最佳細胞類型的識別提供了的見解

基于circRNAs的高度細胞特異性，作者推測了利用circRNAs作為生物標志物來提高細胞類型的可能性。為了構建高質(zhì)量的circRNA特征矩陣，研究了來自17個不同人類和小鼠組織的scRNA-seq隊列以及同源的癌癥樣本（圖5a）。在不同細胞類型和組織類型中所有的circRNA根據(jù)其表達模式被分為5類（圖5b）。隨后，作者總結了人和小鼠樣本中circRNAs的細胞類型特異性，共享的circRNAs的關系如圖5c所示。與之前研究中報道的基因表達圖譜相似，circRNAs 在不同功能的細胞類型之間也表現(xiàn)出不同的表達簇。此外，還檢測到人和小鼠細胞之間的幾種直系同源細胞類型特異性circRNA，這意味著這些circRNA亞群具有保守的生物學功能。

為了驗證circRNA作為細胞類型生物標志物的潛力，計算了在不同細胞類型中表達的circRNA與bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集之間的重疊。如圖5d所示，在bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)中檢測到的circRNA與細胞表達的circRNA具有高度特異性的重疊。例如，在GABAergic神經(jīng)元中檢測到的39.36%的circRNA也可以在正常腦樣本中同時檢測到。為了比較circRNA和基因作為細胞生物標志物在分析腫瘤浸潤細胞中的潛能，只有在人類腫瘤樣本中注釋到的細胞類型被用于下游分析。之后，計算了所有表達的circRNA、來自公共數(shù)據(jù)庫的標志基因和1000個隨機選擇基因的細胞類型特異性。值得注意的是，circRNAs的細胞類型特異性顯著高于標記基因和隨機對照基因，這進一步表明circRNAs作為細胞類型生物標志物的能力（圖5e）。然后，使用CIBERSORT68計算癌癥相關的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中腫瘤浸潤免疫細胞的組成，分別基于LM22基因組的標記基因和細胞類型特異性circRNA的表達（圖5f）?；赾ircRNA和基因的反卷積結果都被整合到 scRNA-seq 隊列中鑒定的10種免疫細胞類型中。隨后利用對數(shù)尺度均方根誤差（RMSE）評估CIBERSORT 提供的細胞特異性反卷積的結果，它代表原始標記基因表達值和推算標記基因表達值之間的偏差。如圖5g所示，使用circRNA的反卷積結果具有顯著更低的RMSE值，這表明circRNA估計細胞組成的效果更準確。這些結果證明了circRNA在探索腫瘤浸潤性免疫細胞異質(zhì)性方面作為更好的細胞類型生物標志物的適用性，也表明了這些circRNA在某些細胞類型中的重要生物學作用。

圖5 探索細胞類型特異性circRNA作為細胞成分去褶積的生物標志物

作者將circRNA的細胞結構和免疫細胞中的circRNA特征矩陣集成到稱為 circRNA單細胞門戶（circSC）的網(wǎng)絡服務器中。circSC提供全面的circRNA信息，包括細胞表達譜、差異表達結果以及在大量人類和小鼠細胞中鑒定的 circRNA 目錄（圖 6）。circSC已作為單獨的模塊集成到circAtlas中（http://circatlas.biols.ac.cn/），為circRNA的單細胞和bulk RNA-seq表達模式提供方便的瀏覽和搜索功能。作者認為該數(shù)據(jù)庫可以作為探索circRNA在胚胎發(fā)育、組織分化和癌癥生物發(fā)生過程中動態(tài)變化的重要資源，并為circRNA群落提供一個獨特而有用的平臺。

圖6 circSC在線網(wǎng)站的建設與功能

參考文獻：

Wu Wanying., Zhang Jinyang., Cao Xiaofei., Cai Zhengyi., Zhao Fangqing.(2022). Exploring the cellular landscape of circular RNAs using full-length single-cell RNA sequencing. Nat Commun, 13(1), 3242. doi:10.1038/s41467-022-30963-8