circCRKL是一種來(lái)源于CRKL的環(huán)狀RNA，通過(guò)海綿化miR-877-5p調(diào)控BCR-ABL，促進(jìn)慢性髓系白血病細(xì)胞增殖

BCR-ABL融合蛋白是導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血?。?/span>CML）發(fā)生的關(guān)鍵因素。伊馬替尼（IM）是一種靶向BCR-ABL抑制劑，可達(dá)到完全緩解。然而，緩解失敗是由于繼發(fā)性BCR-ABL突變引起的獲得性耐藥，這強(qiáng)調(diào)了對(duì)新型BCR-ABL靶向策略的需求。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于腫瘤相關(guān)基因的環(huán)狀RNA （circRNA）可能是相關(guān)腫瘤的治療靶點(diǎn)，但在CML中，這類circRNA的作用尚不清楚。目前有研究揭示了circCRKL在BCR-ABL+細(xì)胞中特異表達(dá)并通過(guò)誘變miR-877-5p調(diào)控BCR-ABL表達(dá)水平，這表明靶向circCRKL聯(lián)合IM治療可作為一種潛在的CML患者治療策略。該研究發(fā)表在《Journal of Translational Medicine》，IF: 8.44。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. circCRKL在CML細(xì)胞系和臨床樣本中的特征

為揭示circCRKL在CML中的潛在作用，采用RT-qPCR檢測(cè)6例CML患者和3例正常供體BMMCs中circCRKL的表達(dá)。相對(duì)于正常供體，circCRKL在CML患者中大量表達(dá)（圖1 A）。BCR-ABL+細(xì)胞系（K562、K562/G01、KCL22和SupB15）與BCRABL -細(xì)胞系（TK6和THP-1）進(jìn)行比較時(shí)，circCRKL在BCR-ABL+細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增高（圖1B）。這些結(jié)果提示circCRKL與BCR-ABL之間可能存在聯(lián)系。生信信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)circCRKL是一個(gè)466 nt的circRNA，由pre-CRKL的2外顯子反向剪接，采用Sanger測(cè)序確定環(huán)化位點(diǎn)（圖1C）。RT-qPCR和RNA分離檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CML細(xì)胞中circCRKL在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平高于細(xì)胞核中的表達(dá)水平（圖1D, E），熒光原位雜交（FISH）進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖1F）。RNase R分析顯示線性CRKL的表達(dá)顯著減少，而circCRKL沒(méi)有變化，表明circCRKL在CML細(xì)胞中是穩(wěn)定的（圖1G, H）。放線菌素D處理，確定了circCRKL和線性CRKL的半衰期，發(fā)現(xiàn)circCRKL的半衰期比線性CRKL的半衰期更長(zhǎng)（圖1I, J）。circCRKL是一種穩(wěn)定的circRNA，定位于CML細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并呈高表達(dá)，提示circCRKL在CML中具有潛在作用。

圖1在BCR-ABL+細(xì)胞系和CML樣品中識(shí)別和表征circCRKL

2. circCRKL促進(jìn)體外BCR-ABL+細(xì)胞增殖

通過(guò)功能缺失試驗(yàn)探討circCRKL在CML中的生物學(xué)作用。構(gòu)建circCRKL敲低CML細(xì)胞，CML細(xì)胞中的circCRKL表達(dá)明顯受到抑制，而線性CRKL表達(dá)不受影響（圖2A, B）。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制circCRKL顯著降低了CML細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2C?F）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，circCRKL沉默減少了S期細(xì)胞的數(shù)量（圖2G, H）。綜上所述，在BCR-ABL+細(xì)胞中，circCRKL是特異性需要的，抑制circCRKL可抑制增殖。

圖2 circCRKL體外促進(jìn)CML細(xì)胞增殖

3. circCRKL沉默可在體內(nèi)損傷CML細(xì)胞的腫瘤發(fā)生

將Sh-NC或sh-circCRKL慢病毒感染的K562/G01細(xì)胞分別靜脈注射到免疫缺陷NOD/SCID小鼠體內(nèi)，建立了CML小鼠模型。與預(yù)期的一樣，對(duì)照組小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)比敲低組小鼠增加更多，但沒(méi)有明顯的差異（p=0.0586）（圖3）。此外，與sh-NC組小鼠相比，敲低circCRKL減輕了脾腫大，但肝臟重量沒(méi)有明顯缺陷（圖3B, C）。為評(píng)估白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)，在小鼠骨髓、肝臟和脾臟中進(jìn)行瑞氏染色。結(jié)果顯示，sh-NC組異種移植模型中有更嚴(yán)重的浸潤(rùn)（圖3D），蘇木精/伊紅（HE）染色也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3E）。免疫熒光顯示circCRKL沉默小鼠中BCR-ABL的水平要低得多（圖3F）。綜上所述，circCRKL在體內(nèi)可以促進(jìn)CML的惡性進(jìn)展。

圖3 circCRKL在體內(nèi)促進(jìn)CML細(xì)胞增殖

4. circCRKL調(diào)控BCR-ABL的表達(dá)，miR-877- 5p是circCRKL和BCR-ABL的靶點(diǎn)

western blot顯示抑制circCRKL的細(xì)胞中BCR-ABL和c-ABL蛋白水平降低（圖4A）。免疫熒光法的結(jié)果與上述結(jié)果一致（圖4B）。RT-qPCR表明，敲低circCRKL降低了BCR-ABL mRNA的表達(dá)（圖4C），表明circCRKL可能在mRNA水平調(diào)控BCR-ABL。然而，circCRKL控制BCR-ABL的機(jī)制尚不清楚。

circCRKL主要存在于CML細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這是circCRKL發(fā)揮miRNA海綿功能的關(guān)鍵前提。因此，從三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（circInteractome、circBank和ENCORI）中篩選了circCRKL的下游miRNA（圖4D）。ENCORI，TargetScan和miRwalk數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與ABL結(jié)合的miRNAs。然后將circCRKL和ABL的miRNAs進(jìn)行重疊（圖4E）。在候選miRNA中，miR-877-5p是一種獨(dú)特的包含circCRKL和ABL-3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的miRNA（圖4F），這是通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)的。當(dāng)miR-877-5p異位表達(dá)時(shí)，野生型circCRKL報(bào)告基因的熒光素酶活性顯著降低，但突變型報(bào)告基因的活性未受影響，這表明circCRKL可能與miR-877-5p在特定位點(diǎn)發(fā)生相互作用（圖4G），miR-877-5p和ABL之間也觀察到類似的結(jié)果（圖4H）。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證circCRKL與miR-877-5p的結(jié)合。RT-qPCR顯示miR-877-5p在K562/G01細(xì)胞中被circCRKL探針特異性富集（圖4I）。此外，先前的研究已經(jīng)注意到AGO2對(duì)于circRNA充當(dāng)miRNA海綿的重要性。在此，進(jìn)行了anti-AGO2 RNA免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)circCRKL和miR-877-5p都可以相互作用，這意味著circCRKL可能充當(dāng)miR-877-5p的海綿（圖4J）。

圖4 circCRKL沉默CML細(xì)胞中BCR-ABL水平下調(diào)

5. miR-877-5p通過(guò)調(diào)節(jié)抑制CML細(xì)胞增殖BCR-ABL

為了明確miR-877-5p在CML中的生物學(xué)相關(guān)性以及BCR-ABL是否受miR-877-5p的調(diào)控，測(cè)定了CML患者BMMCs中miR-877-5p的表達(dá)水平（圖5A），然后分別使用抑制劑或模擬物敲低或過(guò)表達(dá)miR-877-5p。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)抑制劑或模擬物對(duì)CML細(xì)胞中miR-877-5p的影響（圖5B, C）。抑制miR-877-5p后，BCR-ABL mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-877-5p后，BCR-ABL mRNA表達(dá)顯著降低（圖5D）。同樣，western blot顯示抑制miR-877-5p可增強(qiáng)BCR-ABL蛋白水平，而過(guò)表達(dá)miR-877-5p則表現(xiàn)出相反的作用（圖5E）。CCK-8（圖5F, G）和集落形成實(shí)驗(yàn)（圖5H, I）顯示，抑制miR-877-5p刺激CML細(xì)胞增殖，而miR-877-5p過(guò)表達(dá)則相反。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了miR-877-5p是BCR-ABL的負(fù)調(diào)控因子。

圖5 miR-877-5p調(diào)控BCR-ABL表達(dá)

6. circCRKL通過(guò)海綿狀miR-877-5p調(diào)控BCR - ABL促進(jìn)CML細(xì)胞增殖

共轉(zhuǎn)染shcircCRKL和miR-877-5p抑制劑進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)：CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，敲低miR-877-5p明顯恢復(fù)了在CML細(xì)胞中抑制circCRKL引起的生長(zhǎng)抑制（圖6A-D），改善了circCRKL抑制導(dǎo)致的BCR-ABL水平降低（圖6E）。共轉(zhuǎn)染sh-circCRKL和miR-mimic的CML細(xì)胞中BCR-ABL蛋白水平低于sh-circCRKL+mimic-NC細(xì)胞（圖6F）。綜上所述，這些結(jié)果證明了circCRKL通過(guò)調(diào)控miR-877-5p介導(dǎo)的BCR-ABL促進(jìn)CML細(xì)胞增殖。

圖6 circCRKL吸收miR-877-5p增強(qiáng)BCR-ABL，加速CML細(xì)胞增殖

7. 當(dāng)circCRKL被敲除時(shí)，K562/G01細(xì)胞對(duì)伊馬替尼更敏感

考慮到伊馬替尼耐藥細(xì)胞株K562/G01的circCRKL表達(dá)水平高于K562細(xì)胞，推測(cè)circCRKL與伊馬替尼耐藥性之間可能存在聯(lián)系。CCK-8法測(cè)定K562或K562/G01細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的半最大抑制濃度值（IC-50）（圖S2A）。隨后，檢測(cè)穩(wěn)定敲低circCRKL和circCRKL野生型K562/G01細(xì)胞經(jīng)伊馬替尼處理48 h后的細(xì)胞活力并計(jì)算IC-50值。數(shù)據(jù)表明，circCRKL沉默顯著降低了細(xì)胞活力，并且IC-50值同時(shí)降低（圖S2B）。流式細(xì)胞儀顯示，敲低circCRKL可促進(jìn)伊馬替尼處理的K562/G01細(xì)胞的凋亡（圖S2C）。抑制或過(guò)表達(dá)miR-877-5p對(duì)K562/G01細(xì)胞IC-50值沒(méi)有明顯影響（圖S2D）。之前的研究已經(jīng)將Wnt通路與伊馬替尼耐藥聯(lián)系在一起，相應(yīng)的，相關(guān)標(biāo)志物包括CTNNB1和c-Myc也通過(guò)western blot檢測(cè)。數(shù)據(jù)表明，在circCRKL敲低的K562/G01細(xì)胞中，CTNNB1和c-Myc均有明顯缺失（圖S2E）。綜上所示，circCRKL可能通過(guò)介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控K562/G01細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性。

圖S2 circCRKL敲低可改善伊馬替尼耐藥細(xì)胞株K562/G01的敏感性

結(jié)論：

該研究揭示了由CML相關(guān)基因CRKL生成的circCRKL通過(guò)吸附miR-877-5p來(lái)維持BCR-ABL的表達(dá)水平，從而促進(jìn)CML細(xì)胞增殖（圖6G），揭示了circCRKL在伊馬替尼耐藥細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖S2），這為緩解CML患者的耐藥提供了一個(gè)新的視角。然而，circCRKL參與伊馬替尼耐藥的分子基礎(chǔ)仍需進(jìn)一步研究。總之，circCRKL可以引領(lǐng)CML治療靶點(diǎn)的進(jìn)展。