缺氧誘導(dǎo)外泌體circPDK1通過調(diào)控miR-628-3p/BPTF軸和降解BIN1激活c-myc以促進胰腺癌糖酵解

circRNA已被證實在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而，缺氧誘導(dǎo)的外泌體circRNA在胰腺癌中的生物學功能和分子機制仍不清楚。近日，有研究發(fā)現(xiàn)CircPDK1在胰腺癌（PC）腫瘤組織和血清外泌體中高度豐富，并與不良生存相關(guān)。相關(guān)機制發(fā)現(xiàn)，HIF1A通過調(diào)控miR-628-3p/BPTF軸并降解BIN1在轉(zhuǎn)錄水平激活circPDK1。該研究發(fā)表于《Journal of Hematology & Oncology》，IF:14.136。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 體外培養(yǎng)的缺氧PC細胞外泌體可促進PC細胞的惡性生物學行為

缺氧是PC的重要特征，缺氧可增加缺氧PC細胞的外泌體的分泌。通過克隆形成實驗、EdU實驗、CCK-8實驗和transwell實驗檢測常氧外泌體和缺氧外泌體處理后PC細胞的惡性生物學行為。結(jié)果表明，與PBS對照或常氧外泌體相比，缺氧PC細胞來源的外泌體顯著改善MIA PaCa-2和PANC-1細胞的增殖和遷移（圖S1E-H）。與常氧外泌體處理的PC細胞相比，低氧外泌體處理后E-cadherin被顯著抑制。相反，N-cadherin和vimentin蛋白水平升高（圖S1I）。這表明缺氧PC細胞來源的外泌體可以促進PC細胞的活力和遷移。

圖S1體外培養(yǎng)的缺氧PC細胞外泌體可促進PC細胞的腫瘤發(fā)生

2. 通過RNA-seq鑒定缺氧PC細胞外泌體中的circRNA

circRNA在外泌體中大量穩(wěn)定存在，是癌癥的關(guān)鍵調(diào)控因子。為了闡明低氧誘導(dǎo)的外泌體環(huán)狀RNA可能影響腫瘤發(fā)生的作用，使用RNA測序檢測從常氧和低氧PC細胞中純化的外泌體。在低氧外泌體和常氧外泌體之間共鑒定出78個差異表達的環(huán)狀RNA（FC (fold change)?≥?1.5, P?<?0.05）（圖1A，B）。

3. circPDK1在PC中高表達

用qRT-PCR分析正常組織和PC瘤組織中前5個上調(diào)和下調(diào)的環(huán)狀RNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circPDK1是PC中上調(diào)最多的circRNA(圖1C)。然后，用組織芯片中進行ISH檢測。結(jié)果顯示，circPDK1在腫瘤組織中比在配對的正常組織中更豐富(圖1D)， circPDK1的高表達可能與病理階段的晚期有關(guān)(圖1E)。擴大臨床樣本檢測，circPDK1在PC中顯著上調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期病理分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)(圖1F-I)。CircRNA是血清外泌體中潛在的腫瘤標志物。在我們的結(jié)果中，來自血清外泌體的circPDK1在PC患者中大量表達，而在健康對照組中幾乎不存在(圖1J)。此外，血清外泌體中circPDK1的表達水平與PC腫瘤中一致(圖1K)，這使得檢測血清樣本中circPDK1的表達成為可能。綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了circPDK1在PC腫瘤組織中顯著上調(diào)，并可在血清外泌體中穩(wěn)定傳遞和富集。此外，circPDK1的高表達與PC的不良預(yù)后相關(guān)，這使其成為一種潛在的有前途的早期診斷PC的生物標志物。

4. circPDK1在PC細胞中的表達

從PDK1的第7 ~ 10外顯子中獲得circPDK1 (hsa_circRNA_102854, has_circ_0057104, chr2: 173433468-173457776)，長度為401 nt。通過Sanger測序驗證circPDK1的后剪接位點(圖1L)。通過PCR分析，circPDK1的差異引物可以從cDNA而不是gDNA中擴增出來 (圖1M)。與線性PDK1 mRNA相比，RNase R或放線菌素D處理表明circPDK1在PC細胞中是穩(wěn)定的(圖1N, O)。亞細胞分離和FISH檢測結(jié)果表明，circPDK1主要定位于細胞質(zhì)(圖1P, Q)?？傊?，這些結(jié)果表明，circPDK1在PC中是一個豐富的、穩(wěn)定表達的細胞質(zhì)circRNA。

圖1 circPDK1作為PC的外泌體生物標志物的鑒定和circPDK1的特征

5. 外泌體circPDK1在缺氧環(huán)境下被HIF1A激活

研究表明，在缺氧條件下，大量的circRNA被HIF1A轉(zhuǎn)錄激活，其宿主線性基因?qū)⒂上嗤膒re-mRNA產(chǎn)生。在本研究中，circPDK1表達水平與其宿主線性基因PDK1表達水平呈正相關(guān)(圖2A)。此外，circPDK1的表達在7個PC細胞系中無顯著性差異(圖2B)。在缺氧期間，circPDK1的表達水平在細胞和外泌體中均以時間依賴性方式顯著過表達(圖2C, D)。qRT-PCR和IHC證實circPDK1表達與HIF1A表達呈正相關(guān)，HIF1A蛋白水平在PC中上調(diào)(圖2E-G)。利用啟動子序列分析工具，在circPDK1啟動子區(qū)域的宿主基因中驗證了兩個潛在的缺氧反應(yīng)元件(HREs) (圖2H)。雙熒光素酶報告實驗證實，在含有兩個單獨野生型HREs的報告基因中，熒光素酶活性增強，而含有突變型HREs的報告基因?qū)θ毖趸騂IF1A敲除無反應(yīng)(圖2I)。此外，ChIP分析表明，HIF1A可以直接與PDK1啟動子區(qū)結(jié)合，并在低氧條件下增強宿主基因PDK1的轉(zhuǎn)錄(圖2J)。此外，敲低HIF1A可顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的細胞內(nèi)和外泌體circPDK1的豐度(圖2K-M)。ChIP實驗結(jié)果也驗證了低氧條件下RNA聚合酶II與宿主基因PDK1啟動子位點的結(jié)合增強，進一步驗證了circPDK1在低氧條件下可被激活(圖2N)。此外，ActD處理可部分抑制缺氧外泌體培養(yǎng)的PC細胞中circPDK1的表達水平，且缺氧條件下PC細胞中circPDK1的穩(wěn)定性不受影響(圖2O)。總之，這些結(jié)果表明，缺氧外泌體中circPDK1的上調(diào)部分是由于HIF1A的激活。

圖2低氧條件下外泌體circPDK1被HIF1A激活

6. 低氧源性外泌體circPDK1在體內(nèi)外促進PC細胞增殖和轉(zhuǎn)移

為了闡明缺氧來源外泌體circPDK1在PC中的作用，分離MIA PaCa-2和PANC-1細胞來源的不同豐度circPDK1外泌體，并與相應(yīng)的供體細胞共培養(yǎng)，包括4個實驗組:常氧外泌體、缺氧外泌體、缺氧NC外泌體和缺氧sh1-circPDK1外泌體。克隆形成實驗、EdU實驗、CCK-8實驗和transwell實驗檢測缺氧誘導(dǎo)的外泌體對常氧PC細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果表明，缺氧外泌體處理的PC細胞活力和遷移能力增強，而在缺氧外泌體中清除circPDK1后，這種促進增殖和遷移的現(xiàn)象將消失(圖3A-D)。此外，Western blot結(jié)果顯示，與缺氧sh1-circPDK1外泌體相比，低氧NC外泌體處理后的PC細胞E-cadherin明顯受到抑制。相反，與缺氧sh1-circPDK1外泌體處理相比，缺氧NC外泌體處理的PC細胞N-cadherin和vimentin顯著上調(diào)(圖3E)。

小鼠異種移植瘤模型實驗表明，缺氧NC外泌體增加了異種移植腫瘤的體積和重量，而缺氧sh1-circPDK1外泌體消除了缺氧外泌體，從而加速了腫瘤的生長(圖3F-H)。各組裸鼠體重無明顯差異(圖3I)。在肺轉(zhuǎn)移模型中，缺氧sh1-circPDK1外泌體組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量低于乏氧NC組(圖3J)。免疫組織化學染色顯示，缺氧sh1-circPDK1外泌體組PCNA和vimentin表達降低，而N-cadherin表達升高(圖3K)。這些發(fā)現(xiàn)與體外實驗結(jié)果一致，表明缺氧誘導(dǎo)的外泌體circPDK1也可以促進PC細胞體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

圖3缺氧源性外泌體circPDK1促進PC細胞在體外和體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移

7. circPDK1在PC中起miR-628-3p海綿的作用

細胞質(zhì)circRNA通過競爭性海綿化miRNA發(fā)揮ceRNA的功能。circinteractome在線數(shù)據(jù)庫證實circPDK1可能與AGO2結(jié)合(圖4A)。RIP實驗驗證了circPDK1富集于含AGO2的微核糖核蛋白復(fù)合物(圖4B)。因此，通過miRNA測序來篩選對照組和過表達circPDK1組之間潛在的差異表達的miRNA，同時也檢測了circPDK1過表達的效率(圖4C)。途徑富集分析顯示，差異表達的miRNAs富集于泛素介導(dǎo)的蛋白水解、PI3K-AKT signaling pathway和HIF-1signaling pathway等(圖4D)。隨機選取7個被抑制的miRNA，進行qRT-PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-628-3p在過表了circPDK1的MIA PaCa-2細胞中被顯著抑制(圖4E)。RIP檢測也表明miR-628-3p可以與AGO2結(jié)合(圖4F)。在TCGA數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，miR-628-3p在PC腫瘤中顯著被抑制，并且與circPDK1表達呈負相關(guān)(圖4H)。此外，miR-628-3p低表達與不良預(yù)后相關(guān)(圖4I)。circRNA可直接與RNA聚合酶II結(jié)合，激活親本基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中， circPDK1不調(diào)節(jié)miR-628-3p的啟動子活性或pri-miRNA和pre-miRNA的表達(圖4J)。在MIA PaCa-2和PANC-1細胞中，circPDK1過表達后miR-628-3p下調(diào)，而sh1-circPDK1組miR-628-3p上調(diào)(圖4K)。雙熒光素酶報告結(jié)果顯示miR-628-3p直接與circPDK1結(jié)合(圖4L)。這些結(jié)果表明，circPDK1可能與miR-628-3p相互作用，從而在PC細胞中作為miR-628-3p的ceRNA海綿發(fā)揮作用。

圖4 circPDK1在PC中作為miR-628-3p海綿的作用

8. circPDK1作為ceRNA在PC中協(xié)調(diào)BPTF的表達

miR-628-3p在胰腺癌中的潛在功能和作用機制尚不清楚。利用mirDIP、RNAInter、miRDB、miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫，預(yù)測到BPTF、PURA、RBFOX2和ARSJ是miR-628-3p的潛在下游靶點(圖5A)。TCGA的數(shù)據(jù)驗證了潛在下游靶點與miR-628-3p表達之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，BPTF的表達與miR-628-3p呈負相關(guān)，而PURA、RBFOX2和ARSJ的表達與miR-628-3p無關(guān)(圖5B)。circPDK1缺失后的RNA測序結(jié)果顯示172個差異表達的circRNA，包括135個上調(diào)和37個下調(diào)的蛋白編碼基因。BPTF被列為顯著下調(diào)的蛋白編碼基因之一(圖5C)?；蚣患治龃_定了c-myc通路與circPDK1之間的顯著相關(guān)性(圖5 D)。臨床數(shù)據(jù)證實了BPTF和miR-628-3p之間的負相關(guān)(圖5E)。在MIA PaCa-2和PANC-1細胞中轉(zhuǎn)染miR-628-3p模擬物后BPTF的mRNA表達水平降低，而轉(zhuǎn)染miR-628-3p抑制物后BPTF的mRNA表達水平升高(圖5F)。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-628-3p可與BPTF的3?-UTR結(jié)合(圖5G)。因此，BPTF是miR-628-3p的功能性靶基因。此外，PC中BPTF表達水平與circPDK1表達水平呈正相關(guān)(圖5H)。過表達circPDK1顯著激活BPTF-c-myc軸并調(diào)節(jié)c-myc下游靶點CCND1和p21，而轉(zhuǎn)染miR-628-3p模擬物可消除這一作用。通過轉(zhuǎn)染miR-628-3p抑制劑，BPTF-c-myc軸的失活和circPDK1敲低誘導(dǎo)的兩個c-myc下游靶點的調(diào)節(jié)也被消除(圖5I, J)。使用雙熒光素酶報告實驗也獲得了相同的結(jié)果(圖5K)。綜上所述，circPDK1作為ceRNA從海綿化的BPTF mRNA與miR-628-3p結(jié)合，從而從miR-628-3p的抑制作用中釋放BPTF。

圖5 circPDK1作為ceRNA調(diào)節(jié)PC中BPTF的表達

9. circPDK1與BIN1相互作用，增強BIN1的泛素化

RNA pull-down和免疫沉淀實驗證實，作為miRNA海綿的對照circRNA（ciRS-7）不會與BIN1結(jié)合(圖6A)。此外，F(xiàn)ISH分析顯示circPDK1在細胞質(zhì)中與BIN1共定位(圖6B)。circPDK1調(diào)節(jié)BIN1蛋白水平 (圖6C)。此外，circPDK1的表達導(dǎo)致BIN1蛋白水平降低，這可以通過蛋白酶體抑制劑(MG132)恢復(fù)(圖6D)。經(jīng)環(huán)己酰亞胺(CHX)處理后，BIN1在過表達circPDK1的PC細胞中具有較短的半衰期，而在下調(diào)circPDK1的PC細胞中具有較長的半衰期(圖6E)。為了研究與BIN1相互作用的circPDK1區(qū)域，對circPDK1的進行不同截斷，隨后RIP證實截斷3和4與BIN1相互作用(圖6F)?；谏镄畔W在線數(shù)據(jù)庫catRAPID，對截斷3和4中預(yù)測的兩個潛在結(jié)合位點進行突變(圖6G)。此外，circPDK1突變降低了circPDK1和BIN1之間的相互作用(圖6H, I)。這表明，在PC細胞中，circPDK1- wt與BIN1在截短3和4存在相互作用，而circPDK1- mut不存在相互作用。circPDK1-MUT在mRNA或蛋白水平均不影響B(tài)IN1(圖6J)。過表達circPDK1顯著增強BIN1的泛素化水平，但這一作用被突變消除(圖6K)。進一步利用ARES精確構(gòu)建與circPDK1相互作用的BIN1區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果顯示，circPDK1只能在BAR結(jié)構(gòu)域區(qū)域與BIN1結(jié)合，這與catRAPID一致(圖6L)。RNA pull-down實驗結(jié)果表明，缺失BIN1的29-276 aa區(qū)(BAR結(jié)構(gòu)域)會消除其與circPDK1的相互作用(圖6M)。免疫組織化學結(jié)果也顯示，胰腺癌組織中BIN1蛋白水平下調(diào)，并且與組織芯片中的circPDK1呈負相關(guān)(圖6N, O)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，circPDK1可能通過與BIN1的BAR結(jié)構(gòu)域相互作用來調(diào)節(jié)BIN1的穩(wěn)定性，從而促進其泛素依賴性降解。

圖6 circPDK1與BIN1相互作用，增強BIN1的泛素化

10. circPDK1作為一個支架，增強了BIN1蛋白與UBE2O的結(jié)合

UBE2O一種泛素結(jié)合酶，它同時顯示了E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶的活性。RNA pull-down和RIP確認了circPDK1與UBE2O之間的相互作用，而ciRS-7不會與UBE2O結(jié)合(圖7A)。免疫共沉淀(Co-IP)結(jié)果顯示UBE2O與BIN1結(jié)合(圖7B)。FISH和IF表明，circPDK1、UBE2O和BIN1主要在細胞質(zhì)中共定位(圖7C)。qRT-PCR結(jié)果顯示，UBE2O不影響B(tài)IN1和circPDK1的RNA水平，但UBE2O下調(diào)后BIN1蛋白水平明顯升高(圖7D)。此外，circPDK1的缺失顯著減弱了UBE2O對BIN1泛素化和降解的影響(圖7E, F)。Co-IP結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染circPDK1-WT的MIA PaCa-2 PC細胞中UBE2O與BIN1的相互作用增強，而轉(zhuǎn)染circPDK1-MUT的MIA PaCa-2 PC細胞中UBE2O與BIN1的相互作用沒有增強。此外，當用RNase A處理時，UBE2O和BIN1之間的結(jié)合被嚴重破壞，而用RNase R處理時，UBE2O和BIN1之間的結(jié)合沒有被破壞(圖7G)。由于circRNA對RNase R具有耐藥性，因此會被RNase a降解。IHC實驗還發(fā)現(xiàn)PC組織中UBE2O蛋白水平升高，且與BIN1呈負相關(guān)(圖7H, I)。總的來說，circPDK1可以作為支架，增強UBE2O與BIN1的結(jié)合，從而促進UBE2O對BIN1泛素化和降解的影響。隨后作者進行了回復(fù)實驗，證明circPDK1部分通過作為UBE2O和BIN1之間的支架來增強BIN1的降解，從而發(fā)揮致癌作用。

圖7 circPDK1作為一個支架，增強了BIN1蛋白與UBE2O的結(jié)合

11. circPDK1通過兩個互不干擾的軸激活c-myc

BIN1是一個腫瘤抑制因子，它與c-myc相互作用，從而限制c-myc的轉(zhuǎn)錄活性。雙熒光素酶報告實驗表明，轉(zhuǎn)染circPDK1-WT后，c-myc應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄報告基因熒光素酶活性明顯增加，而轉(zhuǎn)染circPDK1-MUT后，c-myc應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄報告基因熒光素酶活性無明顯增加，這種增加被BIN1部分阻斷。BIN1過表達和circPDK1缺失消除了UBE2O增加的熒光素酶活性(圖7J)。綜上所述，circPDK1和UBE2O可以通過降解BIN1蛋白來激活c-myc轉(zhuǎn)錄活性。此外，BIN1和UBE2O不影響miR-628-3p或BPTF表達(圖S13A-C)。同時，miR-628-3p或BPTF不能在RNA或蛋白水平調(diào)控BIN1或UBE2O(圖S13D-E)，表明circPDK1可以通過兩個互不干擾的軸激活c-myc。

圖S13 circPDK1通過兩個非干擾軸激活c-myc

12. circPDK1通過c-myc激活促進有氧糖酵解

c-myc作為circPDK1介導(dǎo)的兩個軸的共同靶點，通過直接激活多種靶點糖酵解基因來滿足快速增殖和轉(zhuǎn)移的需求，是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵介導(dǎo)者。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果表明，circPDK1的缺失顯著抑制了這些糖酵解基因的表達(圖8A, B)。乳酸生成、ATP生成和葡萄糖攝取可以通過circPDK1的缺失來降低(圖8C-F)，以及細胞外酸化速率和氧消耗速率 (圖8G, H)。PET-CT掃描顯示，circPDK1的缺失會顯著抑制小鼠皮下腫瘤的葡萄糖代謝(圖8I)。綜上所述，c-myc介導(dǎo)了circPDK1在糖酵解中的功能。

圖8 circPDK1通過c-myc激活促進好氧糖酵解

結(jié)論：

circPDK1在缺氧PC細胞來源的外泌體中高度富集。circPDK1在胰腺癌患者和血清外泌體中表達上調(diào)，且circPDK1高表達與患者不良預(yù)后相關(guān)。此外，外泌體circPDK1通過增強生長，轉(zhuǎn)移和糖酵解在胰腺癌中發(fā)揮促進腫瘤的作用。HIF1A通過激活宿主基因PDK1上調(diào)circPDK1, circPDK1通過調(diào)控miR-628-3p/BPTF軸并降解BIN1激活c-myc。因此，該研究顯示了circPDK1-c-myc軸促進PC進展的模型機制(圖8J)，為circRNA/miRNA/mRNA和circRNA-RBP相互作用的多樣性提供了新的見解，并強調(diào)了其作為胰腺癌生物標志物和治療靶點的潛在用途。