褪黑激素改善帕金森病

帕金森病(PD)的一個(gè)重要病理生理成分是晝夜節(jié)律紊亂，與循環(huán)褪黑激素(MLT)水平下降密切相關(guān)。近年來(lái)有報(bào)道稱維甲酸相關(guān)孤核受體(RORα)是MLT潛在的內(nèi)源性配體，在多種疾病中發(fā)揮著重要作用。然而，RORα在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。在這里，我們通過(guò)一個(gè)細(xì)胞PD模型顯示，在MPP+處理的BV2細(xì)胞中，RORα表達(dá)下調(diào)，而MLT處理后上調(diào)。在MPTP誘導(dǎo)的小鼠模型中，中腦組織中RORα水平降低，MLT處理顯著提高了RORα水平，保護(hù)了多巴胺神經(jīng)元。此外，siRNA介導(dǎo)的下調(diào)暗示了STAT通路的參與。總之，MLT通過(guò)抑制STAT相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎極化來(lái)改善神經(jīng)炎癥，為PD的神經(jīng)保護(hù)治療提供了替代方案。本文于2022年7月發(fā)表于“NPJ Parkinson’s Disease”（IF=9.304）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）RORα在MPP+處理的BV2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

為探討RORα是否參與PD的炎癥過(guò)程，我們首先研究了不同濃度(0-100 μM)的MPP+對(duì)BV2細(xì)胞的生物學(xué)作用。結(jié)果顯示50 μM MPP+誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活力下降25-30%(補(bǔ)充圖，未展示)。RT-qPCR和WB分析顯示，MPP+-處理的BV2細(xì)胞中，低劑量(10和20 μM) MPP+處理后，RORα的表達(dá)增加，但在高劑量(50 μM)時(shí)顯著降低(圖1a-c)。我們還觀察到，隨著MPP+濃度的增加，促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)逐漸增加，而IL-10等抗炎因子逐漸減少(圖1d)。RORα表達(dá)的改變與細(xì)胞因子水平的改變提示RORα在PD中具有抗炎癥作用。

2） MLT在體外增加RORα表達(dá)，抑制促炎性M1樣小膠質(zhì)細(xì)胞極化，減少神經(jīng)炎癥

我們探索了MLT對(duì)MPP+處理的BV2細(xì)胞的潛在抗炎機(jī)制。RT-qPCR和WB分析表明，MLT（50μM）完全逆轉(zhuǎn)了MPP+在50μM時(shí)誘導(dǎo)的RORα的降低，盡管最終水平低于單獨(dú)使用MLT（圖2a-c）。同時(shí)，ELISA檢測(cè)到MLT處理后抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平升高，促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）濃度顯著降低（圖2d），進(jìn)一步證實(shí)了MLT在MPP+處理的BV2細(xì)胞中的抗炎作用。此外，在PD的進(jìn)展過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞極化在神經(jīng)炎癥發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。因此，我們進(jìn)一步分析了MLT對(duì)細(xì)胞模型中小膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響。在應(yīng)用MPP+前半小時(shí)應(yīng)用MLT，并在藥物干預(yù)后24小時(shí)通過(guò)RT-qPCR測(cè)量極化標(biāo)志物。結(jié)果表明，MLT治療降低了促炎分子（如iNOS、CD36、IL-1β、TNF-α）以及DAM表型因子如TREM2和TLR4的基因表達(dá)，但增加了抗炎M2樣標(biāo)記物CD206和ARG-1的表達(dá)（圖2e-g）。這些結(jié)果表明，RORα通過(guò)減少小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎性M1和DAM表型標(biāo)記物的表達(dá)，在MLT的抗炎作用中發(fā)揮作用。

3）MPTP處理的小鼠中RORα表達(dá)降低，且MLT顯示出減輕MPTP的抗炎作用

為了研究RORα與體內(nèi)PD之間的關(guān)系，我們使用MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型。與體外結(jié)果一致，MPTP處理的小鼠的中腦組織RORα水平下調(diào)（圖3a-c）。為了探討MLT在體內(nèi)是否具有相同的抗炎作用，在MPTP注射前半小時(shí)注射MLT。我們觀察到，與對(duì)照組相比，MLT治療組的小鼠在運(yùn)動(dòng)功能方面表現(xiàn)更好（未展示）。MLT治療后，炎癥因子（包括IL-6、IL-1β、TNF-α）的血清水平降低，而抗炎因子（如IL-4和IL-10）顯著增加（圖3d）。此外，免疫熒光顯示MLT處理可防止TH陽(yáng)性細(xì)胞在SNc中丟失（圖3e，f）。這些結(jié)果表明，MLT對(duì)DA神經(jīng)元具有抗炎和保護(hù)作用，從而改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠模型的運(yùn)動(dòng)癥狀。

4）MLT增加MPTP處理小鼠的RORα水平，并降低促炎和DAM相關(guān)基因表達(dá)

我們觀察到，MLT治療顯著增加了中腦組織的RORα水平（圖4a-c）。RORα的免疫組織化學(xué)染色圖像顯示了類(lèi)似的結(jié)果（圖4d，e），表明MLT的作用可能與RORα有關(guān)。此外，我們研究了MLT是否能改變MPTP誘導(dǎo)的小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞表型。MPTP和MLT+MPTP處理組的小膠質(zhì)細(xì)胞均因IBA-1的增加而激活。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，促炎M1樣和DAM表型標(biāo)記物減少，而抗炎M2樣表型分子增加(圖3g-i)。類(lèi)似地，MLT處理組中IBA1+iNOS+細(xì)胞的熒光強(qiáng)度小于MPTP組，而MLT+MPTP組中IBA1+ARG-1+細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高于MPTP組（圖4f，g）。總之，MLT處理通過(guò)下調(diào)促炎和DAM相關(guān)分子改變了小膠質(zhì)細(xì)胞表型。

5）RORα缺失促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎表型極化，加重神經(jīng)炎癥

據(jù)報(bào)道，RORα可在多種疾病中發(fā)揮抗炎作用。為了驗(yàn)證RORα在MLT對(duì)MPP+處理的BV2細(xì)胞的影響中是否發(fā)揮了類(lèi)似的作用，我們進(jìn)一步確定了RORα缺失對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化和炎癥的分子效應(yīng)。SiRNA用于敲除RORα。此外，在MPP+干預(yù)前，我們還使用了SR3335，一種合成的RORα選擇性逆激動(dòng)劑，和SR1078，一種合成的RORα激動(dòng)劑。在蛋白質(zhì)水平上，與MPP+處理組相比，MLT和SR1078處理組均顯示出抗炎作用。然而，SR3335并未增加MPP+處理細(xì)胞中TNF-α的水平或降低IL-10的水平。更重要的是，與MLT+MPP+的非沉默組相比，RORα敲除增加了培養(yǎng)基中促炎因子（TNF-α和IL-1β）的水平，并降低了抗炎因子（IL-10）（圖5a）。同時(shí)，免疫熒光圖像顯示的iNOS的上調(diào)和ARG-1的下調(diào)也表明，BV2細(xì)胞中的RORα缺失可增強(qiáng)促炎極化（圖5b，c）。在mRNA水平上，RT-qPCR顯示出一致的結(jié)果，但MLT處理細(xì)胞組中ARG1表達(dá)除外。MLT+MPP+處理的細(xì)胞顯示免疫染色強(qiáng)度增加，但ARG-1的mRNA減少（圖5d）。這些結(jié)果表明RORα參與了MLT的抗炎作用。

6）MLT通過(guò)STAT的RORα依賴的信號(hào)通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化

據(jù)報(bào)道，MLT的抗炎作用與STAT通路的激活有關(guān)。為了進(jìn)一步探索與MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和MLT介導(dǎo)的抗炎相關(guān)的信號(hào)通路，我們檢測(cè)了關(guān)鍵信號(hào)分子STAT的表達(dá)和磷酸化，尤其是STAT1和STAT3。結(jié)果表明，在MPP+刺激的BV2s中，p-STAT1的表達(dá)增加，而p-STAT3的表達(dá)顯著降低。MLT預(yù)處理抑制p-STAT1的表達(dá)，但激活STAT3磷酸化。為了驗(yàn)證RORα是否參與MLT對(duì)STAT通路的影響，使用siRNA來(lái)敲除RORα。與沒(méi)有RORα-siRNA的細(xì)胞組相比，RORα的缺乏顯著降低了p-STAT3的水平，但增加了MLT預(yù)處理引起的STAT1的磷酸化（圖6a，b）。這些結(jié)果表明MLT通過(guò)RORα-STATs途徑介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型變化。

結(jié)論：本研究證明MLT通過(guò)改變小膠質(zhì)細(xì)胞的表型標(biāo)志物減輕神經(jīng)炎癥。MLT調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)變，且RORα在小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該發(fā)現(xiàn)指出了MLT-RORα軸的有益作用，其可減少炎癥反應(yīng)并改善PD。

參考文獻(xiàn)：

Li J, Liu H, Wang X, Xia Y, Huang J, Wang T, Lin Z, Xiong N. Melatonin ameliorates Parkinson's disease via regulating microglia polarization in a RORα-dependent pathway. NPJ Parkinsons Dis. 2022 Jul 8;8(1):90. doi: 10.1038/s41531-022-00352-5.