PDX1、EN2和MSX1高甲基化可預測結(jié)直腸癌的預后

大量研究表明DNA甲基化改變與癌癥進展之間的關系，但只有少數(shù)基因被證實可作為結(jié)直腸癌（CRC）的診斷生物標志物。近日，有研究發(fā)現(xiàn)PDX1, EN2和MSX1的高甲基化可以預測結(jié)直腸癌患者的預后，該研究發(fā)表在《Experimental & Molecular Medicine》，IF：12.125。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 通過靶向亞硫酸氫鹽測序鑒定CRC組織中的差異甲基化區(qū)域

為了觀察CRC和其他類型癌癥中的甲基化水平，從TCGA收集了5種癌癥類型（COAD、READ、LIHC、AD和PAAD）的微陣列數(shù)據(jù)（圖1a）。根據(jù)人類基因組ref. （hg19）將每個CpG位點的beta值取平均值，以代表其匹配的CpG島的甲基化值。根據(jù)一下標準進一步過濾所選擇的CpG島：健康組織和腫瘤組織之間的甲基化值差異應該大于20%； 20%的癌癥患者應該存在這種差異。最終獲得了10,754個差異甲基化的CpG島（圖1b）。作者使用NimbleDesign軟件設計選定的CpG島來探測池 （圖1c）。

從104例韓國CRC患者的組織中獲得了基因組DNA，根據(jù)制造商說明書制備靶向亞硫酸氫鹽測序文庫（圖1d）。為了識別一些患者不特異的差異甲基化區(qū)域，在計算健康組織和腫瘤組織的總體平均值后，選擇差異超過30%的區(qū)域（圖1e）。最終在腫瘤組織中鑒定出40個差異甲基化的CpG島，包括35個高甲基化區(qū)域和5個低甲基化區(qū)域。健康組織中平均甲基化水平為29%，腫瘤組織中為78.7%，在83.3%的CRC患者中觀察到這種差異（表1）。

圖1結(jié)直腸癌隊列特異性DNA甲基化生物標志物選擇的總體流程

表1列出了從90例結(jié)直腸癌患者的靶向亞硫酸氫鹽測序數(shù)據(jù)中選擇的候選CpG島及其匹配的基因，并提供了有關CpG島及其鄰近基因的基因組和功能位置信息。

2. 候選基因的選擇，以發(fā)展結(jié)直腸癌生物標志物

根據(jù)啟動子、基因內(nèi)和基因間區(qū)域觀察40個差異甲基化CpG島的位置時，作者觀察到在腫瘤的35個高甲基化區(qū)域中，16個CpG島位于啟動子區(qū)域，18個位于基因內(nèi)區(qū)域，1個位于基因間區(qū)域。在5個低甲基化區(qū)域中，1個在啟動子區(qū)域，4個在基因內(nèi)區(qū)域（圖2a和表1）。此外，在18個高甲基化的基因內(nèi)區(qū)域中，有7個基因（PDX1、GRIN2D、PITX1、TFAP2A、EN2、MSX1和NR2E1）在腫瘤中表達增加了2倍以上（圖2b）。為了確定這7個基因的上調(diào)水平，作者還在TPM值上檢查了其他候選基因的表達，然后剔除了NR2E1，因為它缺乏統(tǒng)計學意義（圖2c）。此外，相關性檢測分析發(fā)現(xiàn)PDX1、EN2和MSX1在腫瘤中的表達水平高于正常組織，且甲基化和表達水平呈正相關（圖2b、c）。通過檢測基因的表達與CRC患者生存率之間的關系，發(fā)現(xiàn)PDX1、EN2、MSX1的高表達與患者生存呈負相關（圖2d）。因此，后續(xù)決定集中研究這三個基因。

圖2基于差異基因表達及其與CRC患者生存結(jié)局相關性的候選DNA甲基化生物標志物基因

3. PDX1、EN2或MSX1過表達促進人結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲

功能分析實驗表現(xiàn)，過表達PDX1、EN2和MSX1增加了癌細胞增殖（圖3a），顯著促進HCT116細胞的遷移（圖3b），這些結(jié)果表明PDX1, EN2和MSX1的過表達與CRC細胞的增殖和遷移直接相關。因此，作者推測如果這些基因的基因內(nèi)區(qū)域的甲基化變化與基因表達的變化相關，那么檢測標記區(qū)域的甲基化變化將能夠預測細胞狀況。

圖3篩選出的候選DNA甲基化生物標志物基因通過促進細胞增殖和遷移來驅(qū)動體外致癌特性

4. 設計MSP引物以最佳檢測甲基化變化

為了設計針對PDX1基因內(nèi)CpG島的MSP引物，作者檢測了該區(qū)域80個單個CpG位點的甲基化變化。雖然大多數(shù)CpG位點在腫瘤組織和健康組織之間的甲基化變化有很大差異，但最終根據(jù)候選CpG島中每個CpG位點的甲基化水平的熱圖和線形圖設計了MSP引物（圖4a）。PDX1正向引物有4個CpG位點，反向引物有3個CpG位點。這7個CpG位點的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴增子大小為126 bp和123 bp, Tm為55-57℃（圖4a）。EN2的正向引物和反向引物都有三個CpG位點。6個CpG位點的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴增子大小分別為127 bp和112 bp, Tm為57-58℃（圖4b）。MSX1正向引物和反向引物均有3個CpG位點。6個CpG位點的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴增子大小分別為151 bp和144 bp, Tm為55-57℃（圖4c）。

圖4甲基化特異性PCR （MSP）中引物結(jié)合位點選擇和引物設計的優(yōu)化基準

5. MSP引物可有效檢測感興趣區(qū)域的甲基化狀態(tài)

在每個CpG島，甲基化引物在SW480、LoVo和HCT116細胞中均產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而在CCD-18Co細胞中未產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。相反，在CCD-18Co細胞中檢測到未甲基化的引物，而在SW480、LoVo和HCT116細胞中未檢測到。半甲基化引物未能在CCD-18Co、SW480、LoVo和HCT116細胞中顯示出明顯的差異（圖4d-f）。當我們作者甲基化引物時，SW480、LoVo和HCT116細胞的甲基化水平顯著高于CCD-18Co細胞，而使用半甲基化引物時則沒有（圖4d-f）。此外，通過qMSP觀察了CCD-18Co和SW480細胞的差異甲基化水平，發(fā)現(xiàn)對于PDX1，即使是0.5 ng的模板DNA也足以觀察到這種差異（圖4g-i）。從這些結(jié)果證實了MSP引物可以非常有效地區(qū)分癌細胞和正常細胞。

6. 建立的MSP引物可以檢測甲基化狀態(tài)的動態(tài)變化

為了檢測MSP引物是否可以區(qū)分甲基化水平的動態(tài)變化，作者使用CRISPR/dCas9-TET1系統(tǒng)（dCas9-TET系統(tǒng)）以位置特異性的方式降低甲基化水平（圖5a）。在將dCas9-TET系統(tǒng)引入PDX1基因組區(qū)域后，使用包含7個CpG位點的甲基化引物檢測到甲基化水平顯著降低。然而，半甲基化引物無法檢測到這一差異（圖5b）。隨著基因內(nèi)區(qū)域甲基化水平的降低，PDX1的表達顯著降低，表明甲基化的變化與基因表達的變化直接相關（圖5c），且EN2和MSX1得到了相似的結(jié)果。使用甲基化引物，能成功檢測到EN2和MSX1基因內(nèi)區(qū)域的甲基化水平降低，這與基因表達的降低一致（圖5d-g）。因此，甲基化引物可以檢測到在基因表達變化之前發(fā)生的甲基化變化。

圖5定制的MSP引物檢測由CRISPR/dCas9-gRNA系統(tǒng)調(diào)控的SW480候選生物標志物的甲基化變化

7. PDX1、EN2和MSX1的甲基化水平預測結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

接下來，作者研究了PDX1、EN2和MSX1的基因內(nèi)CpG區(qū)域的甲基化水平是否具有臨床意義。作者利用曼哈頓距離進行層次聚類，根據(jù)這些區(qū)域的甲基化水平對患者進行分類，得到兩個組：高甲基化組（組1,N = 26），中間甲基化和低甲基化組（組2,N = 61）（圖6a）。這兩組在OS（圖6b）和PFS率（圖6c）方面存在顯著差異。此外，周圍淋巴、血管和神經(jīng)侵犯是腫瘤轉(zhuǎn)移后的特征性事件，這些事件在組1中發(fā)生率高于組2。然而，未觀察到細胞分化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和腫瘤位置的差異，因為大多數(shù)IV期（轉(zhuǎn)移后）患者被納入組1，而大多數(shù)III期（轉(zhuǎn)移前）患者被納入組2（表2）。這些結(jié)果表明，PDX1, EN2和MSX1甲基化水平可以預測CRC患者的預后。

最后，研究MSP系統(tǒng)是否可以區(qū)分這兩個患者組。與組2中的5例患者相比，組1中的2例患者在PDX1、EN2和MSX1的基因內(nèi)區(qū)域顯示出更高的甲基化水平（圖6d）。該結(jié)果表明，MSP檢測系統(tǒng)可用于臨床預測結(jié)直腸癌患者的預后和術(shù)后轉(zhuǎn)移。

圖6通過對CRC患者的分類顯示了3個基因甲基化標簽的預后潛力

表2 根據(jù)PDX1、EN2和MSX1基因內(nèi)CpG島甲基化水平分組，收集臨床資料

結(jié)論：

在這項研究中，作者提出了一種識別CRC預后標志物的實用方法。作者利用公共數(shù)據(jù)庫并生成合適的高深度靶向亞硫酸氫鹽測序數(shù)據(jù)來定義韓國東南部特異性差異甲基化區(qū)域（DMRs）。此外，在體外驗證了PDX1, EN2和MSX1基因內(nèi)CG基因的增殖能力，并提出了優(yōu)化的qMSP方法，以進一步應用于臨床領域?；陉犃谢颊叩碾S訪數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)靶向CGI高甲基化的CRC患者的OS顯著降低，復發(fā)率較高。除了手術(shù)活檢、輔助化療和其他適當治療外，定期追蹤預后因素可能對晚期CRC患者有幫助。