神經(jīng)損傷特異性長鏈非編碼RNA通過增加Ccl2表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)性疼痛

背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)中神經(jīng)損傷相關(guān)基因的適應(yīng)性改變是神經(jīng)性疼痛發(fā)生的關(guān)鍵。新的證據(jù)支持長鏈非編碼RNA(lncRNAs)在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中的作用。在這里，作者鑒定了一種保守的lncRNA，命名為神經(jīng)損傷特異性lncRNA(NIS-lncRNA)，NIS-lncRNA可能通過促進(jìn)FUS觸發(fā)的DRG Ccl2表達(dá)參與神經(jīng)性疼痛，可能是神經(jīng)性疼痛管理的一個潛在靶點。該研究于2022年7月發(fā)表在《The Journal of Clinical investigaton》，IF：11.864。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. NIS-lncRNA的鑒定

首先通過RNA測序數(shù)據(jù)庫的分析確定了NIS-lncRNA。使用鏈特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并在小鼠、大鼠和人類的DRG中鑒定出NIS-lncRNA轉(zhuǎn)錄物(圖1A)。利用快速擴(kuò)增cDNA末端對5'端和3'端及逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行定向測序PCR(RT-PCR)檢測發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)，NIS-lncRNA有NIS V1和NIS V2共2個變體(圖1B)。使用Northern blot分析，SNL后7天，損傷小鼠DRGs中NIS V1和V2的大小與預(yù)期一致(圖1C)。兩種變體的轉(zhuǎn)錄本也在未發(fā)育的小鼠的脊髓、不同的大腦區(qū)域和其他身體器官中表達(dá)(圖1D)。對DRG提取物的核/細(xì)胞質(zhì)RNA的定量分析表明，兩種變體在細(xì)胞核中的富集程度高于在細(xì)胞質(zhì)中的含量(圖1E)。此外，這兩種變體的體外翻譯沒有產(chǎn)生蛋白質(zhì)(圖1F)。核糖體分析顯示NIS-lncRNA無/極少量核糖體(圖1G)。這些證據(jù)表明NIS-lncRNA是一種非編碼RNA。

圖1. DRGs中NIS-lncRNA的鑒定

2. DRG NIS-lncRNA上調(diào)對周圍神經(jīng)損傷的特異性反應(yīng)

接下來，作者進(jìn)行了定量RT-PCR分析和增加樣本模板策略，來檢測周圍神經(jīng)損傷后，NIS-lncRNA在2個疼痛相關(guān)區(qū)域DRGs和脊髓的表達(dá)。SNL，而非Sham(假手術(shù))，在同側(cè)L4 DRG中NIS V1和V2在術(shù)后第3天至第28天均有時間依賴性上調(diào)(圖2A)。SNL和Sham均未改變這2個變體在對側(cè)L4 DRG，同側(cè)完整的L3 DRG和同側(cè)L4脊髓中的基礎(chǔ)表達(dá)(圖2B-D)。在另一種由單側(cè)坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(CCI)引起的神經(jīng)性疼痛動物模型中，結(jié)果相似(圖2E和F)。有趣的是，在單側(cè)后爪足底注射完全弗氏佐劑引起的慢性炎性疼痛動物模型(圖2G)、單側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)注射單碘乙酸鈉引起的慢性炎性疼痛動物模型(圖2H)和單側(cè)后爪足底切開引起的術(shù)后疼痛動物模型(圖2I)中，觀察期間同側(cè)的L3/4 DRGs中NIS V1和V2水平均未發(fā)生明顯變化。

圖2. 雄性小鼠周圍神經(jīng)損傷后DRGs中NIS V1和V2表達(dá)上調(diào)

通過RNAscope原位雜交(ISH)和不同細(xì)胞標(biāo)志物的免疫組化分析，觀察NIS-lncRNA在DRG中的細(xì)胞分布模式。在SNL后大量檢測到NIS V1或V2標(biāo)記的信號粒子(圖3A)。在受損DRGs的單個細(xì)胞中，兩種變體均與β-微管蛋白III(一種特異性神經(jīng)元標(biāo)志物)共表達(dá)，但不與谷氨酰胺合成酶(一種衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)和CD68(一種巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞標(biāo)志物)共表達(dá)(圖3A和B)。定量分析顯示在SNL后第3、7和14天，同側(cè)L4 DRG中NIS V1或V2標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量顯著高于對側(cè)L4 DRG(圖3C-F)。重要的是，SNL后上述天數(shù)，損傷DRGs神經(jīng)元中NIS V1或V2標(biāo)記的信號顆粒(≥3)在細(xì)胞核中的富集程度高于細(xì)胞質(zhì)(圖3C-F)。神經(jīng)元胞體的橫截面積分析表明，這些變化主要發(fā)生在SNL小鼠的中型和大型DRG神經(jīng)元中(圖3G和H)。綜上所述，這些證據(jù)表明神經(jīng)損傷誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元中的NIS-lncRNA表達(dá)上調(diào)可能在神經(jīng)性疼痛中起功能性作用。

圖3. SNL后雄性小鼠DRGs中NIS V1或V2標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量顯著增加

3. ELF1在SNL后觸發(fā)DRG NIS-lncRNA轉(zhuǎn)錄活性

接下來，作者研究DRG NIS-lncRNA在神經(jīng)損傷后是如何上調(diào)的。利用數(shù)據(jù)庫JASPAR確定了NIS-lncRNA啟動子區(qū)域中E74樣ETS轉(zhuǎn)錄因子1(ELF1)的共有結(jié)合基序(–227TGGGGAGGAAGTT–215)。在偽核片段中，可以從ELF1抗體免疫沉淀復(fù)合物中擴(kuò)增出含有該結(jié)合基序的NIS-lncRNA啟動子片段(圖4A)。SNL后同側(cè)L4 DRG的結(jié)合活性增加2.4倍(圖4A)，ELF1 mRNA和ELF1蛋白水平升高(圖4B和C)，表明SNL增加了ELF1與NIS-lncRNA啟動子的結(jié)合。

在體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，進(jìn)一步觀察到過表達(dá)ELF1誘導(dǎo)NIS-lncRNA增加(圖4D和E)。熒光素酶測定顯示，共轉(zhuǎn)染全長Elf1載體顯著增加了體外CAD細(xì)胞中NIS-lncRNA啟動子的活性(圖4F)。在手術(shù)前3天通過DRG微注射Elf1 siRNA來阻斷SNL誘導(dǎo)的DRG ELF1增加，同時減弱了SNL誘導(dǎo)的同側(cè)L4 DRG中NIS V1和V2水平的增加(圖4G和H)。此外，在siRNA微注射前35天，在亂序siRNA微注射的小鼠中，DRG微注射AAV5-Elf1而不是AAV5-Gfp，在siRNA微注射后第7天增加了注射的L3/4 DRGs中NIS V1和V2的量，在siRNA微注射后第5天和第7天，雄性小鼠對同側(cè)機(jī)械、熱和冷刺激的反應(yīng)增強(qiáng)(圖4I和J)。研究結(jié)果表明神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的NIS-lncRNA上調(diào)至少部分歸因于ELF1在受傷的DRGs中的高表達(dá)。

圖4. ELF1在SNL后觸發(fā)受損DRG中的NIS-lncRNA上調(diào)

4. 阻斷上調(diào)的DRG NIS-lncRNA可緩解神經(jīng)性疼痛

在雄性小鼠的CCI或Sham前4天，將在體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中顯著敲低NIS-lncRNA及其2個變體的NIS-lncRNA siRNA微注射到單側(cè)L3/4 DRGs 中。這種微注射不僅阻斷了CCI誘導(dǎo)的同側(cè)L3/4 DRGs在CCI后第5天NIS V1和V2水平的升高(圖5A)。也改善了CCI后第3天和第5天CCI引起的同側(cè)機(jī)械、熱和冷傷害性超敏反應(yīng)(圖5B-D)。

作者生成了NIS-lncRNAfl/fl小鼠，并發(fā)現(xiàn)手術(shù)前35天將AAV5-Cre而不是AAV5-Gfp微注射到同側(cè)L3/4 DRGs的雄性小鼠，在CCI后14天阻斷了CCI誘導(dǎo)的同側(cè)L3/4 DRGs中NIS V1和V2水平的增加(圖5E)。同時也減輕了CCI后第3天至第14天CCI引起的同側(cè)機(jī)械、熱和冷傷害性超敏反應(yīng)的發(fā)展(圖5F-I)。在CCI后第7天，在AAV5-Cre微注射的NIS-lncRNAfl/fl小鼠中，同側(cè)的機(jī)械、熱和冷傷害性超敏反應(yīng)完全發(fā)生(圖5J-M)。從CCI后的第14天到第28天，這些傷害性超敏反應(yīng)顯著減弱(圖5J-M)。此外，在CCI后28天，與刺激無關(guān)的自發(fā)持續(xù)疼痛在AAV5-Cre微注射的NIS-lncRNAfl/fl小鼠中也顯著減少(圖5N)。

綜上所述，作者的研究結(jié)果強(qiáng)烈表明，在受損DRGs中上調(diào)NIS-lncRNA對神經(jīng)性疼痛的發(fā)生和維持是必需的。

圖5. 阻斷DRG NIS-lncRNA上調(diào)可減輕雄性小鼠神經(jīng)性疼痛的發(fā)生和維持

5. 模擬神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的DRG NIS-lncRNA上調(diào)產(chǎn)生傷害性超敏反應(yīng)

將表達(dá)全長NIS V1(AAV5-V1)或V2(AAV5-V2)的AAV5微注射到天然雄性小鼠的單側(cè)L3/4 DRGs中，AAV5-Gfp用作對照。在病毒微注射8周后，注射的DRGs中NIS V1和V2的水平顯著增加(圖6A)。AAV5-V1或AAV5-V2的DRG微注射導(dǎo)致響應(yīng)機(jī)械刺激的縮爪頻率增加和響應(yīng)注射側(cè)的熱或冷刺激的縮爪潛伏期降低(圖6B-E)。這些行為變化發(fā)生在微注射后2到4周之間，并持續(xù)至少8周(圖6B-E)。DRG微注射AAV5-V1或AAV5-V2均可在微注射8周后產(chǎn)生獨立的自發(fā)持續(xù)疼痛(圖6F和G)。微注射后8周，在同側(cè)L3/4背角也檢測到了p-ERK1/2和GFAP水平的顯著增加，表明神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活躍(圖6H)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在沒有神經(jīng)損傷的情況下，DRG NIS-lncRNA上調(diào)可能會產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛樣癥狀。

圖6. DRG過表達(dá)NIS-lncRNA在未發(fā)病雄性小鼠中產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛樣癥狀

6. NIS-lncRNA上調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)損傷后DRGs中Ccl2的激活

為闡明DRG NIS-lncRNA上調(diào)參與神經(jīng)性疼痛的機(jī)制，進(jìn)行了高通量RNA測序，以確定雄性小鼠受傷DRGs中NIS-lncRNA調(diào)節(jié)的下游靶點。趨化因子Ccl2 mRNA是重疊基因中最引人注目的一個基因，是神經(jīng)性疼痛的關(guān)鍵因素。分別將AAV5-V1和AAV5-V2轉(zhuǎn)導(dǎo)到培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，NIS V1和V2的過表達(dá)顯著增加了Ccl2 mRNA的表達(dá)水平(圖7A)。SNL在SNL后3至14天增加了雄性小鼠同側(cè)L4 DRG中Ccl2 mRNA和CCL2蛋白的量(圖7B和C)。DRG微注射AAV5-Cre而不是AAV5-Gfp時，SNL或CCI誘導(dǎo)的Ccl2 mRNA和CCL2蛋白的增加在雄性或雌性NIS-lncRNAfl/fl小鼠的同側(cè)L4 DRG中被顯著阻斷(圖7D和E)。相反，通過將AAV5-V1微注射到用對照干擾siRNA處理的雄性小鼠單側(cè)L3/4 DRG中，DRG過表達(dá)NIS V1不僅使同側(cè)(非對側(cè))對機(jī)械、熱和冷刺激產(chǎn)生了更強(qiáng)的爪子退縮反應(yīng)(圖8A-D)。但也升高了同側(cè)L3/4 DRG中Ccl2 mRNA和CCL2蛋白的水平(圖7F和G)。在AAV5-V1微注射后第35天，在DRG微注射Ccl2 siRNA或腹膜內(nèi)微注射CCR2拮抗劑CCR2-RA-[R]可阻斷這些增強(qiáng)的行為反應(yīng)(圖7F和G，圖8A-H)。通過DRG微注射AAV5-Elf1過表達(dá)ELF1也增加了用對照亂序siRNA處理的雄性小鼠注射的DRG中Ccl2 mRNA和CCL2蛋白的量(圖7H和I)。在AAV5-Elf1微注射35天后，通過DRG微注射NIS-lncRNA siRNA，這些增加顯著減弱(圖7H和I)。總之，這些證據(jù)表明上調(diào)的NIS-lncRNA可能參與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的受損DRG中Ccl2基因的轉(zhuǎn)錄激活。

圖7. 上調(diào)的NIS lncRNA是SNL誘導(dǎo)的雄性小鼠受損DRG中CCL2增加所必需的

圖8. 通過藥理抑制或基因敲除DRG CCL2可減輕雄性小鼠DRG NIS V1過表達(dá)引起的傷害性超敏反應(yīng)

7. 模擬神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的DRG NIS-lncRNA上調(diào)可增加CCL2介導(dǎo)的DRG神經(jīng)元興奮性

在單獨微注射AAV5-Gfp(Gfp)或AAV5-NIS-lncRNA V1和AAV5-Gfp(NIS)的混合病毒溶液后4-5周，在同側(cè)L3/4 DRG的急性分離神經(jīng)元中進(jìn)行全細(xì)胞電流鉗記錄。Gfp(NIS)進(jìn)入野生型(WT)或Ccl2-敲除(KO)雄性小鼠的單側(cè)L3/4 DRGs(圖9A和B)。NIS微注射的WT小鼠對機(jī)械、熱和冷刺激的反應(yīng)增強(qiáng)在NIS微注射的Ccl2-KO小鼠中受損(圖8I-L)。與Gfp微注射的WT小鼠相比，NIS微注射的WT小鼠的小型、中型和大型DRG神經(jīng)元靜息膜電位去極化率分別為5.1、4.5和3.6 mV(圖9C)，而rheobase電位分別降低了49%、43%和36%(圖9D)。此外，與注射Gfp的WT小鼠相比，注射NIS的WT小鼠的小型、中型和大型DRG神經(jīng)元也表現(xiàn)出由注射電流誘發(fā)的動作電位數(shù)量增加(圖9E-H)。在來自NIS微注射的WT小鼠的小型和中型但不是大型的DRG神經(jīng)元中觀察到自發(fā)活動的頻率顯著增加(圖9I和J)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明CCL2可能介導(dǎo)NIS-lncRNA上調(diào)誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元興奮性增加。

圖9. DRG過表達(dá)NIS-lncRNA增加CCL2介導(dǎo)的DRG神經(jīng)元興奮性

8. FUS介導(dǎo)神經(jīng)損傷后DRGs中NIS-lncRNA上調(diào)誘導(dǎo)的Ccl2表達(dá)

在體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，特定的NIS V1和V2感測RNA探針可以分別拉低FUS，而相應(yīng)的陰性對照反義RNA探針則不能(圖10A)。NIS V1和V2片段均在雄性小鼠的體內(nèi)假DRGs中被抗FUS抗體(但不是正常純化的IgG)免疫沉淀(圖10B)。與Sham組相比，SNL后第7天損傷DRGs中這兩種免疫沉淀活性分別顯著增加3.2倍和3倍(圖10B)。研究結(jié)果表明，在周圍神經(jīng)損傷后，NIS-lncRNA與受損DRG中FUS結(jié)合的能力增加。

此外，通過DRG Fus siRNA微注射防止CCI誘導(dǎo)的FUS水平升高，在CCI后第5天阻斷了受損DRGs中CCL2量的增加(圖10C)。通過DRG微注射AAV5-Fus(而不是AAV5-Gfp)，過表達(dá)FUS顯著提高了NIS-lncRNAfl/fl雄性小鼠微注射DRG中Ccl2 mRNA和CCL2蛋白的水平(圖10D和E)。與Sham組相比，在 SNL后第7天，來自AAV5-Gfp微注射的NIS-lncRNAfl/fl小鼠的損傷DRGs的R7和R8中的結(jié)合活性分別增加了5.4倍和3倍(圖10F和G)。熒光素酶測定表明，在體外共轉(zhuǎn)染全長Fus載體加對照亂序siRNA的CAD細(xì)胞中，Ccl2基因啟動子被顯著激活，但在全長Fus載體加NIS-lncRNA siRNA共轉(zhuǎn)染時沒有被激活(圖10H)。總之，作者的數(shù)據(jù)表明FUS介導(dǎo)NIS-lncRNA促進(jìn)外周神經(jīng)損傷后受損DRGs中Ccl2表達(dá)的增加。

圖10. NIS-lncRNA是FUS觸發(fā)的受傷DRGs中CCL2表達(dá)所必需的

結(jié)論：

綜上所述，作者證明了NIS-lncRNA觸發(fā)的機(jī)制，通過該機(jī)制，Ccl2在神經(jīng)性疼痛條件下選擇性地在受損的DRGs中被轉(zhuǎn)錄激活?？紤]到NIS-lncRNA僅在受損的DRG神經(jīng)元對外周神經(jīng)損傷的特異性反應(yīng)中上調(diào)，而阻止這種上調(diào)可阻斷神經(jīng)性疼痛的發(fā)展并逆轉(zhuǎn)其維持，而不影響基礎(chǔ)/急性疼痛和運動功能。因此，NIS-lncRNA可能是緩解神經(jīng)性疼痛的潛在治療靶點。