抑制肝癌的咽喉，還得看circRNAs的表演

大量的研究表明circRNAs可以通過與結(jié)合蛋白相互作用、海綿化miRNAs和調(diào)節(jié)蛋白翻譯來實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控。但是circRNA是如何通過m6A修飾形成一個(gè)反饋環(huán)從而導(dǎo)致肝癌的機(jī)制還沒有相關(guān)文獻(xiàn)說明。本研究證明circGPR137B通過circGPR137B/miR-4739/FTO反饋環(huán)路抑制肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究于2022年6月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、  circGPR137B下調(diào)與HCC患者預(yù)后不良相關(guān)

對3對肝癌組織樣本進(jìn)行了circRNA表達(dá)譜分析。與癌旁正常組織相比，熱圖顯示HCC組織中，鑒定出96個(gè)上調(diào)的circRNA和51個(gè)下調(diào)的circRNA (圖1B )?；鹕綀D顯示，has-circ-0017114，一個(gè)來源于線性RNA GPR137B的circ RNA，在HCC中呈表達(dá)下調(diào)，命名為circGPR137B (圖1C )。circRNA圖譜和RT-qPCR顯示，與癌旁正常組織相比，HCC中circGPR137B表達(dá)降低（圖1D-1E）。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)與circGPR137B高表達(dá)組比較，circGPR137B低表達(dá)組具有較差的生存預(yù)后（圖1H-1I）。以上結(jié)果表明circGPR137B下調(diào)和HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 circGPR137B下調(diào)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)

2、  circGPR137B在HCC中的特征

has-circ-0017114位于染色體14q1，由G蛋白偶聯(lián)受體137B ( GPR137B )位點(diǎn)第1、7外顯子區(qū)衍生而成。HepG2和Hep3B細(xì)胞在RNase R處理2h后，GPR137B的表達(dá)水平顯著下降，而circGPR137B中在HepG2和Hep3B細(xì)胞中，由于其對RNase R的抗性，circGPR137B沒有明顯的變化(圖2B )。作者隨后考察了在指定時(shí)間點(diǎn)暴露于轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D后，circGPR137B的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)，在HepG2和Hep3B細(xì)胞中，circGPR137B的轉(zhuǎn)錄半衰期顯著遠(yuǎn)長于線性GPR137B（圖2C）。qPCR和FISH分析表明，與線性GPR137B（圖2D-2E）相比，circGPR137B主要定位于HCC組織的染色細(xì)胞質(zhì)中。

圖2 circGPR137B在肝癌細(xì)胞中的特征

3、  在體外，circGPR137B抑制HCC細(xì)胞的生長和侵襲

研究檢測了6株HCC細(xì)胞系中circGPR137B的表達(dá)，作者通過qRT-PCR分析，估計(jì)了circGPR137B在多個(gè)HCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，circGPR137B在SK-hep-1細(xì)胞系中高表達(dá)，而在HepG2和Hep3B細(xì)胞系中低表達(dá)（圖3A）。后續(xù)在SK-hep-1細(xì)胞系中進(jìn)行circGPR137B的敲低實(shí)驗(yàn)，在Hep3B中進(jìn)行circGPR137B過表達(dá)實(shí)驗(yàn)（圖3B）。MTT，集落形成和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示circGPR137B過表達(dá)HCC細(xì)胞的生長和侵襲，circGPR137B敲低則效果相反（圖3C-3E）。以上表明circGPR137B在HCC中發(fā)揮抑癌作用。

圖3 circGPR137B抑制體外細(xì)胞生長和侵襲

4、  在HCC中miR-4739的表達(dá)和circGPR137B負(fù)相關(guān)和HCC不良預(yù)后相關(guān)

根據(jù)circRNA表達(dá)譜和miRbase數(shù)據(jù)庫鑒定， circGPR137B具有與5個(gè)miRNA結(jié)合的潛力(圖4A )，其結(jié)合位點(diǎn)如圖4B所示。作者們分析了hepG2細(xì)胞中5個(gè)miRNA mimics處理后的circGPR137B的熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)相比其他miRNA，miR-4739顯著降低了circGPR137B的熒光素酶活性(圖4C )。FISH分析顯示miR-4739表達(dá)水平顯著升高（圖4D-4E），且與circGPR137B呈負(fù)相關(guān)（圖4F）。TCGA數(shù)據(jù)也證實(shí)miR-4739表達(dá)在HCC中顯著上調(diào)，且和不良預(yù)后相關(guān)（圖4G-4H）。以上說明HCC中miR-4739高表達(dá)且預(yù)示不良預(yù)后。

圖4 miR-4739與circGPR137B和肝癌預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)

5、  circGPR137B在肝癌中充當(dāng)miR-4739的海綿

在HepG2和Hep3B細(xì)胞中circGPR137B異位表達(dá)可降低miR-4739的表達(dá)(圖5B )，而miR-4739模擬物對circGPR137B的表達(dá)無影響。將野生型或變異型circGPR137B 3′UTR的PRL- TK-p MIR-Luc載體與miR-4739模擬物共轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-4739 mimics降低了野生型circGPR137B 3′UTR的熒光素酶活性，但對變異型circGPR137B 3′UTR的熒光素酶活性沒有影響，變異型miR-4739也對HepG2和Hep3B細(xì)胞中野生型circGPR137B 3′UTR的熒光素酶活性沒有影響（圖5C）。此外，根據(jù)一個(gè)在線循環(huán)RNA相互作用組，指出了Ago2在circGPR137B區(qū)域的占有率。RIP檢測進(jìn)一步的證明，與輸入對照相比，Ago2顆粒中表達(dá)Ago2的HepG2和Hep3B下調(diào)的內(nèi)源性circGPR137B和miR-4739的富集顯著提高了（圖5D）。此外，在HepG2細(xì)胞中，通過FISH分析發(fā)現(xiàn)circGPR137B與miR-4739之間存在胞質(zhì)共定位（圖5E）。將circGPR137B慢病毒與HepG2和Hep3B細(xì)胞中的miR-4739模擬物共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示miR-4739促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，并抵消了circGPR137B的抑瘤作用（圖5F-5G）。

圖5 circGPR137B在肝癌中充當(dāng)miR-4739的海綿

6、FTO受circGPR137B/miR?4739軸調(diào)控，提示肝癌預(yù)后良好

miR-4739模擬物可降低野生型FTO 3'UTR的熒光素酶活性，但對變異型FTO 3'UTR沒有影響，與miR-NC組相比，變異型miR-4739對HepG2和Hep3B細(xì)胞野生型FTO 3'UTR的熒光素酶活性沒有影響（圖6B）。此外，qRT-PCR和Western Blot分析表明，miR-4739模擬物顯著降低FTO、p21、p27、cleaved caspase-3/9和E-cadherin的表達(dá)，增加N-cadherin和vimentin的表達(dá)（圖6C-6D）。將FTO質(zhì)粒與miR-4739模擬物共轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)FTO的異位表達(dá)阻止了細(xì)胞增殖、集落形成和細(xì)胞侵襲，逆轉(zhuǎn)了miR-4739的促瘤作用（圖6E-6G）。這些證實(shí)了m6A脫甲基化酶FTO可能是miR-4739的靶點(diǎn)（圖6A）。

根據(jù)RT-qPCR和Western Blot分析，與癌旁正常組織（圖7A-7B）相比，10份HCC組織樣本FTO的表達(dá)顯著降低。在50對配對和371對未配對的肝癌組織中驗(yàn)證了這一結(jié)果（圖7C）。然后，作者發(fā)現(xiàn)FTO表達(dá)下降與HCC的年齡和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，F(xiàn)TO高表達(dá)組的生存率明顯高于低表達(dá)組（圖7D）。即：FTO表達(dá)在HCC組織中顯著下降，且FTO下調(diào)與HCC預(yù)后不良有關(guān)。

圖6 在HCC中，FTO受circGPR137B/miR-4739軸調(diào)控。

圖7 FTO下調(diào)提示肝癌預(yù)后不良。

7、FTO介導(dǎo)m6A修改circGPR137B形成一個(gè)具有circGPR137B的正反饋環(huán)

作者推測FTO介導(dǎo)的m6A修飾的circGPR137B可以抑制HCC的進(jìn)展。MeRIP和m6A斑點(diǎn)雜交表明，F(xiàn)TO過表達(dá)降低了HepG2和Hep3B細(xì)胞的總m6A水平和circGPR137B m6A水平（圖8A-8C），但增加了circGPR137B RNA水平（圖8D）。敲除FTO可降低circGPR137B的表達(dá)（圖8E）。隨后，干擾circGPR127B使miR-4739表達(dá)增加，F(xiàn)TO表達(dá)下調(diào)（圖8F），反之，F(xiàn)TO表達(dá)增加（圖8G）。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)FTO可與HCC細(xì)胞中的circGPR137B結(jié)合（圖8H）。然而，F(xiàn)TO對GPR137B m6A水平?jīng)]有影響，不能與GPR137B結(jié)合。進(jìn)一步的功能研究表明，敲低circGPR137B能夠促進(jìn)HepG2和Hep3B細(xì)胞的增殖和侵襲，并抵消FTO誘導(dǎo)的HepG2和Hep3B細(xì)胞（圖8I-8J）的抗腫瘤作用。

圖8 FTO介導(dǎo)m6A修飾的circGPR137B與之形成正反饋回路

8、circGPR137B抑制體內(nèi)肝癌的發(fā)生和肺轉(zhuǎn)移

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circGPR137B或pcDNA3.1的熒光素酶標(biāo)記的HepG2細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。采用活體成像檢查熒光素酶信號，結(jié)果顯示，circGPR137B組腫瘤組織的熒光素酶信號較對照組弱（圖9A）。而且circGPR137B組的腫瘤似乎比對照組小。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明circGPR137B組腫瘤體積和重量均減小（圖9B-9C）。HE染色顯示腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，免疫組化分析顯示，與對照組相比，circGPR137B組Ki-67和FTO水平更低（圖9D）；qRT-PCR分析進(jìn)一步顯示，與對照組相比，過表達(dá)circGPR137B組miR-4739表達(dá)降低，F(xiàn)TO表達(dá)升高（圖9E）。在體內(nèi)阻斷circGPR137B對腫瘤生長有促進(jìn)作用（圖9F）。免疫組化分析顯示，與對照組相比，sh-circGPR137B組Ki-67水平升高，F(xiàn)TO水平降低（圖9G）；qRT-PCR分析進(jìn)一步顯示，與對照組相比，sh-circGPR137B組miR-4739表達(dá)升高，F(xiàn)TO表達(dá)降低（圖9H）。

采用活體成像檢查熒光素酶信號，結(jié)果顯示肝臟腫瘤生長伴腹膜轉(zhuǎn)移。circGPR137B組熒光素酶信號較對照組明顯減弱（圖10A）。circGPR137B組小鼠肝臟腫瘤的大小出現(xiàn)小于對照組的情況，與對照組相比，circGPR137B組小鼠體重不變但肝臟重量減輕（圖10B）。此外，尾靜脈注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circGPR137B或CON的HepG2細(xì)胞建立肺轉(zhuǎn)移模型。作者發(fā)現(xiàn)，circGPR137B組轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的形成率較對照組肺重量減輕（圖10C）。HE染色顯示，circGPR137B組原位肝腫瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞數(shù)量減少，IHC分析顯示，circGPR137B組肝臟腫瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤組織Ki-67指數(shù)降低，F(xiàn)TO表達(dá)升高（圖10D）；qRT-PCR顯示，與對照組相比，circGPR137B過表達(dá)使原位肝腫瘤miR-4739表達(dá)降低，F(xiàn)TO表達(dá)升高（圖10E）。綜上所述，circGPR137B能夠抑制體內(nèi)肝癌的發(fā)生和肺轉(zhuǎn)移。

圖9 circGPR137B抑制體內(nèi)肝癌的發(fā)生

圖10 circGPE137B抑制體內(nèi)肝癌肺轉(zhuǎn)移

結(jié)論

研究結(jié)果證明，circGPR137B通過與FTO mRNA結(jié)合的miR-4739海綿誘導(dǎo)FTO蛋白表達(dá)，以抑制其表達(dá)。FTO蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，介導(dǎo)circGPR137B的m6A去甲基化，促進(jìn)其表達(dá)。因此，circGPR137B產(chǎn)生正反饋，從而強(qiáng)烈抑制肝癌細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和肺遷移。本研究為circRNA和m6A修飾形成的反饋環(huán)路提供了直接證據(jù)，從而對表觀遺傳學(xué)產(chǎn)生了新的見解。

圖11 本研究的機(jī)制模擬圖

參考文獻(xiàn)

Liu L, Gu M, Ma J, Wang Y, Li M, Wang H, Yin X, Li X.(2022). CircGPR137B/miR-4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 21(1):149. doi: 10.1186/s12943-022-01619-4.